اساس مولکولی چنگال همانندسازی از طریق ریپریمینگ توسط PRIMPOL مجددا راه اندازی می شود

ژنوم های یوکاریوتی در معرض منابع متعدد آسیب DNA قرار دارند که مانع از تکثیر می شوند. فقط یک دهه پیش، بازپرداخت توسط پریماز-پلیمراز PRIMPOL به عنوان مسیری شناسایی شد که سلول‌ها را قادر می‌سازد تا آسیب DNA را تحمل کنند 1، 2، 3، 4. با این حال، مکانیسم مولکولی که زیربنای ریپریمینگ است هنوز به خوبی شناخته نشده است، و مشخص نیست که چگونه PRIMPOL دقیقا به سمت چنگال‌های متوقف شده، جایی که در امتداد DNA تک رشته‌ای PRIMPOL متصل می‌شود و چگونه PRIMPOL تنظیم می‌شود تا سنتز DNA مستعد خطا را به حداقل برساند.

در اینجا، برای تشریح اساس مولکولی بازپرداخت، تصویربرداری تک مولکولی در زمان واقعی را در عصاره‌های هسته‌ای انجام می‌دهیم که حفظ ژنوم را خلاصه می‌کند. ما مستقیما نحوه راه‌اندازی مجدد چنگال‌های متوقف شده از طریق repriming را تجسم می‌کنیم. ما نشان می‌دهیم که PRIMPOL از طریق تعامل با هلیکاز تکراری CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) به چنگال‌های متوقف شده جذب می‌شود. این انتقال پرایمر از PRIMPOL به پلیمراز ε با کیفیت بالا را تسهیل می کند و سنتز DNA جهش زا را به حداقل می رساند.

در غلظت‌های نزدیک به فیزیولوژیک، PRIMPOL رشته‌های پیشرو را به روشی وابسته به CMG و پلیمراز ε آن آغازگرها را گسترش می‌دهد. این حالت اولیه بازپرداخت نیازی به سیگنال دهی ایست بازرسی آسیب DNA ندارد. بیان بیش از حد PRIMPOL و فعال‌سازی نقطه بازرسی یک حالت ثانویه از repriming را ترویج می‌کند، به موجب آن PRIMPOL سنتز DNA را دور از CMG دوباره شروع می‌کند و پلیمراز δ آن آغازگرها را گسترش می‌دهد. داده‌های ما مکانیسم ساده و در عین حال مؤثری را نشان می‌دهند که فعالیت PRIMPOL را به سمت چنگال‌های متوقف شده در انتظار راه‌اندازی مجدد هدایت می‌کند و استراتژی را برای مهار مسیر repriming پیشنهاد می‌کند.

مسیرهای چندگانه، پایداری ژنوم را در طول تنش همانندسازی (RS) 5 حفظ می‌کنند، از جمله وارونگی چنگال و سنتز DNA translesion (TLS) 6. در سال 2013، یک مسیر جدید پاسخ RS به نام repriming در یوکاریوت های 1، 2، 3، 4 شناسایی شد. PRIMPOL repriming را انجام می دهد و سلول ها را قادر می سازد تا ضایعات DNA متنوع 1، 2، 3، 4، 7، 8 را تحمل کنند. از آنجایی که PRIMPOL فاقد تصحیح است، دارای نرخ خطای قابل مقایسه با پلیمرازهای TLS (10-2-10-4) 9، 10 است.

سلول‌ها و موش‌های فاقد PRIMPOL به چندین عامل آسیب‌رسان به DNA حساس هستند (8، 11، 12، 13)، که بر نقش آن در حفظ ژنوم تأکید می‌کند. در حالی که بازپروری سلول های سرطانی را قادر می سازد RS ناشی از انکوژن 14 و شیمی درمانی 15 را تحمل کنند، PRIMPOL شکاف های DNA تک رشته ای (ssDNA) 16، 17 را ایجاد می کند که سلول ها را نسبت به مهارکننده های PARP حساس می کند. مسدود کردن واژگونی چنگال باعث تقویت مجدد می‌شود، و نشان می‌دهد که سلول‌ها از مسیرهای با وفاداری بالا برای به حداقل رساندن سنتز DNA جهش‌زا استفاده می‌کنند 7، 21، 22.

هلیکاز مشابه CMG DNA والدین 23 را باز می کند و از نظر عملکردی با پلیمراز ε (Pol ε) 24 که رشته پیشرو را سنتز می کند، جفت می شود. رشته عقب مانده به ترتیب توسط پریماز-پلیمراز α (Pol α) و پلیمراز δ (Pol δ) آغاز و گسترش می یابد. به دلیل ماهیت ناپیوسته سنتز قطعه اوکازاکی 25، 26، آسیب روی رشته عقب مانده به آسانی دور زده می شود. این مورد برای ضایعات DNA پیشرو رشته ای نیست، که Pol ε را متوقف می کند در حالی که CMG به باز کردن DNA ادامه می دهد 25، 26، 27. این جداسازی CMG ssDNA را که به سرعت توسط پروتئین همانندسازی A (RPA) پوشش داده می‌شود، آشکار می‌کند.

این تصور که PRIMPOL ممکن است سنتز رشته‌های پیشرو را دوباره آغاز کند در زمان کشف آن فرض شد 2، و در کارهای بعدی 7، 16، 29 مورد بحث قرار گرفت، اما هیچ مدرک مستقیمی برای این ایده وجود ندارد.

اگر چه repriming یک مسیر اصلی پاسخ RS است و PRIMPOL یک هدف درمانی جذاب است، جنبه‌های مکانیکی کلیدی repriming همچنان نامشخص است. به عنوان مثال، اگرچه RPA PRIMPOL را به ssDNA 30، 31 استخدام می کند، مشخص نیست که چرا PRIMPOL در فورک های متوقف شده عمل می کند، اما نه بر روی ssDNA تولید شده توسط فرآیندهای دیگر (رونویسی، نوترکیب). یک مطالعه گزارش داد که غلظت بالای RPA از فعالیت PRIMPOL بر روی ssDNA در شرایط آزمایشگاهی 30 جلوگیری می کند، احتمالا به این دلیل که RPA به طور کامل ssDNA را می پوشاند و از دسترسی PRIMPOL به الگو جلوگیری می کند.

مطالعه دیگری نشان داد که RPA فعالیت PRIMPOL را روی ssDNA به اندازه کافی تحریک می کند تا اتصال همزمان هر دو پروتئین را انجام دهد، Pol ε می تواند پرایمرهای PRIMPOL را در شرایط آزمایشگاهی گسترش دهد و RPA فعالیت آنزیمی PRIMPOL را در همکاری با Pol ε31 تحریک می کند. هنوز مشخص نیست که چگونه repriming در هسته رخ می دهد، جایی که RPA فراوان است و به سرعت ssDNA در معرض را می پوشاند. اگرچه PRIMPOL یک هدف شناخته شده از ایست بازرسی کیناز 1 (CHK1) 22 است، نحوه تنظیم مجدد بازرسی ایست بازرسی آسیب DNA هنوز به درستی شناخته نشده است.

در نهایت، مشخص نیست که چگونه PRIMPOL برای به حداقل رساندن سنتز DNA جهش زا در طول بازپرداخت تنظیم می شود.

برای پرداختن به این سوالات، ما از تصویربرداری تک مولکولی برای تجسم مستقیم راه اندازی مجدد چنگال وابسته به PRIMPOL در عصاره تخم Xenopus استفاده کردیم. ما دریافتیم که PRIMPOL ترجیحا نزدیک چنگال‌های متوقف شده متصل می‌شود، که نشان می‌دهد با پروتئین‌های مرتبط با چنگال تعامل دارد. ما یک تعامل بین PRIMPOL و CMG را شناسایی کردیم که برای هدف‌گیری PRIMPOL به چنگال‌های متوقف شده و برای راه‌اندازی مجدد چنگال کارآمد در عصاره هسته‌ای و در سلول‌های انسانی لازم است.

داده‌های ما نشان می‌دهد که تعامل PRIMPOL-CMG انتقال پرایمر را از PRIMPOL به رشته پلیمراز Pol ε تسهیل می‌کند، بنابراین سنتز DNA جهش‌زا را به حداقل می‌رساند. در نهایت، در شرایطی که بیان بیش از حد PRIMPOL را تقلید می‌کند، متوجه شدیم که PRIMPOL می‌تواند سنتز DNA را دور از هلیکاز همانندسازی دوباره آغاز کند، و آن آغازگرها توسط Pol δ گسترش می‌یابند. یافته‌های ما از یک مکانیسم ساده و در عین حال شیک پشتیبانی می‌کند که فعالیت PRIMPOL را به‌طور خاص برای چنگال‌های متوقف شده هدف قرار می‌دهد و راهبردی را برای جلوگیری از سرکوب مجدد پیشنهاد می‌کند.

برای بررسی مکانیسم راه‌اندازی مجدد چنگال وابسته به PRIMPOL، از عصاره هسته‌ای تهیه‌شده از تخم‌های Xenopus laevis استفاده کردیم. این عصاره حاوی تمام پروتئین‌های هسته‌ای محلول است، از همانندسازی کارآمد DNA پشتیبانی می‌کند و چندین مسیر پاسخ RS را خلاصه می‌کند. ما نتوانستیم PRIMPOL قورباغه را در عصاره تخم مرغ با استفاده از طیف سنجی جرمی (MS) یا وسترن بلاتینگ تشخیص دهیم (داده های توسعه یافته شکل 1a,b و جدول تکمیلی 1). برای بازسازی مجدد، ما عصاره هسته ای را با PRIMPOL انسانی نوترکیب تکمیل کردیم که فعالیت آنزیمی قوی را در شرایط آزمایشگاهی نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 1c,d).

برای تجسم راه اندازی مجدد چنگال با واسطه PRIMPOL در زمان واقعی، ما یک سنجش تک مولکولی به نام سینتیک تکثیر یوکاریوتی از طریق تصویربرداری و ردیابی مولکولی (KERMIT) 25، 34 را اقتباس کردیم. یک الگوی DNA خطی بیوتینیله دو بار روی یک ورقه پوششی پوشیده شده با استرپتاویدین در یک سلول جریان میکروسیالی متصل شد (شکل 1a). DNA با مایع رویی پرسرعت انکوبه شد - عصاره‌ای که از صدور مجوز منشاء پشتیبانی می‌کند، اما از شلیک منشأ، تقلید از G1 (مرجع 32) پشتیبانی می‌کند (شکل 1a). سلول جریان با بافر برای حذف پروتئین های محلول در حالی که MCM2-7 متصل به DNA را حفظ می کرد، شسته شد.

DNA دارای مجوز با عصاره نوکلئوپلاسمی انکوبه شد - عصاره ای که از شلیک منشاء، ازدیاد طول و پاسخ RS پشتیبانی می کند و از فاز S 32 تقلید می کند (شکل 1a). تکرار در زمان واقعی با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کل نظارت شد.

a، گردش کار تصویربرداری تک مولکولی. b، کیموگرام هایی که دینامیک CMG را در چنگال های بدون مزاحمت نشان می دهد. GINS-LD655 (نارنجی) هلیکاز CMG را ردیابی می کند و FEN1-KikG (آبی) به عنوان نشانگر DNA نوپا عمل می کند. ج، دینامیک CMG در عصاره تیمار شده با آفیدیکولین. d، دینامیک CMG در عصاره تهی شده از Pol-α. e، دینامیک CMG در عصاره تخلیه شده از Pol-α با 30 نانومتر WT PRIMPOL. فلش های سفید نشان دهنده رویدادهای راه اندازی مجدد فورک وابسته به PRIMPOL هستند. f، کارایی راه‌اندازی مجدد فورک: کسری از CMGهای جدا نشده که جابجایی سریع را از سر گرفتند. داده ها میانگین ± 95٪ فاصله اطمینان (CI) تخمین زده شده توسط بوت استرپ است.

n مقدار تعداد فورک ها را نشان می دهد. g، دینامیک CMG در ضایعات DNA در عصاره تخلیه نشده. فلش‌های زرد نشان‌دهنده توقف چنگال در محل ضایعه است. ساعت، سرعت CMG در آزمایش‌های مختلف اندازه‌گیری شد. خطوط آبی میانه ها را نشان می دهد، مناطق سایه دار نشان دهنده 95٪ CI است که توسط بوت استرپ تخمین زده شده است. n مقدار تعداد مولکول های CMG را نشان می دهد. Ctrl، کنترل i، دینامیک CMG در ضایعات DNA در عصاره + 30 نانومتر WT PRIMPOL. فلش های سفید رویدادهای راه اندازی مجدد با واسطه PRIMPOL را نشان می دهد. آزمایش های نشان داده شده در b – h دو بار با آماده سازی عصاره های مختلف تکرار شد.

j، اتورادیوگرام سنجش تکثیر پلاسمید در تقلید شده (i) در مقابل عصاره + بافر فاقد Pol-α (ii)، +3 نانومولار WT PRIMPOL (iii)، + 10 نانومولار WT PRIMPOL (iv)، +30 نانومولار WT PRIMPOL (v)، +30MP vii (PRIMPOL) PRIMPOL (ΔRPA) (vii). کارتون‌ها واسطه‌های تکثیر مربوط به نوارهای روی ژل را نشان می‌دهند (آبی نشان‌دهنده DNA نوپا است). k، کمی سنجش تکرار پلاسمید نشان داده شده در j از سه تکرار مستقل.

سیگنال سنتز DNA کل (خاکستری تیره) یا DNA ابرپیچ (خاکستری روشن) در 90 دقیقه اندازه گیری شد و به سیگنال کل واکنش 30 نانومولار WT PRIMPOL نرمال شد. داده ها میانگین ± s.d هستند. از سه آزمایش مستقل مقادیر P با استفاده از آزمون‌های دو نمونه‌ای کولموگروف-اسمیرنوف (f و h) و آزمون‌های t دو طرفه دانشجویی (k) محاسبه شد. NS، معنی دار نیست (P> 0.05). * P <0.05، ** P <0.01، **** P <0.0001.

برای تجسم CMG، از عصاره تهی شده از GINS همراه با GINS با برچسب فلورسنت (GINS-LD655) استفاده کردیم. برای نظارت بر سنتز DNA، ما عصاره را با FEN1-KikG (فلپ اندونوکلئاز 1 ذوب شده به پروتئین فلورسنت KikG) تکمیل کردیم 35. FEN1 از طریق تعامل با PCNA 36 به کروماتین وارد می شود و قبلا به عنوان نشانگر DNA نوپای 37 تأیید شده بود که به فعالیت آنزیمی FEN1 نیاز ندارد.

در عصاره تهی شده ساختگی، شلیک مبدا دو CMG واگرا ایجاد کرد که با سرعتی در حدود 300 نوکلئوتید در دقیقه حرکت می کردند و سیگنال FEN1-KikG در پشت هر هلیکاز جمع می شد (شکل 1b). برای القای RS، عصاره با 15 میکرومولار آفیدیکولین (APH) تکمیل شد - یک مهارکننده پلیمرازهای خانواده B (شامل α، ε و δ) که PRIMPOL را مهار نمی کند (داده های توسعه یافته شکل 1d). در عصاره تیمار شده با APH، CMG 10× کندتر از نمونه ساختگی بدون هیچ سیگنال FEN1-KikG همراه بود که نشان دهنده شکست در سنتز DNA است (شکل 1c).

این کاهش قابل توجه CMG در طول RS (که توسط ما 25 و دیگران گزارش شده است 38) مشخصه جداسازی CMG 28 است (شکل 1b,c). افزودن 30 نانومتر PRIMPOL از نوع وحشی (WT) به عصاره تیمار شده با APH از راه اندازی مجدد چنگال پشتیبانی نمی کند (داده های توسعه یافته شکل 1e)، نشان دهنده این واقعیت است که APH Pol ε و δ را مهار می کند و از گسترش پرایمرهای PRIMPOL جلوگیری می کند.

برای خلاصه کردن RS بدون مهار Pol ε/δ، دو استراتژی مستقل ابداع کردیم. اول، ما Pol α را از عصاره هسته ای نقص ایمنی کردیم (تخلیه یا مهار Pol α قبلا برای القای RS در سلول های 22، 39، 40، 41 استفاده می شد). در عصاره تهی شده از Pol-α، CMGها بسیار آهسته حرکت کردند (حدود 30 نوکلئوتید در دقیقه) بدون هیچ گونه تجمع FEN1 (شکل 1d). این نشان دهنده جدا شدن هلیکاز است و با گزارش هایی که Pol α برای ایجاد سنتز رشته های پیشرو مورد نیاز است مطابقت دارد.

هنگامی که عصاره تهی شده از Pol-α با WT PRIMPOL نوترکیب تکمیل شد، ما به طور معمول مشاهده کردیم که CMGهای آهسته/غیر جفت نشده ناگهان به حدود 300 نوکلئوتید در دقیقه سرعت دادند (شکل 1e (فلش های سفید)). ما این سوئیچ را به پیشرفت سریع CMG به عنوان راه اندازی مجدد فورک تعبیر می کنیم. حدود 75% از چنگال های متوقف شده در عصاره تهی شده Pol-α همراه با 30 نانومولار WT PRIMPOL مجددا راه اندازی شدند، در مقابل تنها حدود 5% راندمان راه اندازی مجدد در واکنش های تکمیل شده با بافر (شکل 1f و داده های توسعه یافته شکل 1f).

نکته مهم، تغییر ناگهانی از پیشرفت آهسته به سریع CMG با تجمع FEN1-KikG در پشت چنگال همراه بود، که نشان دهنده سنتز DNA است (شکل 1e). برای تأیید این ایده که پیشرفت سریع CMG با سنتز DNA مطابقت دارد، ما این آزمایش‌ها را با PCNA نشاندار شده با فلورسنت (PCNA-LD655) تکرار کردیم - یک نشانگر تثبیت شده برای DNA نوپا 44، 45. مانند FEN1-KikG، PCNA-LD655 در پشت چنگال های راه اندازی مجدد انباشته می شود (داده های توسعه یافته شکل 1g). ایجاد اختلال در تعامل FEN1 با PCNA، اتصال FEN1–KikG را حذف کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1h) بدون ضربه زدن به راه‌اندازی مجدد چنگال (تصویر Extended Data شکل.

1i). ما نتیجه می‌گیریم که FEN1-KikG توسط PCNA به DNA نوپا جذب می‌شود و افزایش ناگهانی CMG نشان‌دهنده راه‌اندازی مجدد چنگال است. ما متعاقبا از FEN1-KikG به عنوان نشانگر سنتز DNA استفاده کردیم زیرا سیگنال به نویز بهتری را نسبت به PCNA-LD655 ارائه می‌کرد (روش‌ها).

دوم، ما یک سوبسترای DNA با ضایعات DNA اختصاصی بر روی الگوی رشته اصلی طراحی کردیم که هر کدام از یک ترکیب اضافی پپتیدی کوچک (حدود 4 اسید آمینه) تشکیل شده است (داده های توسعه یافته شکل 2a). این ضایعه باید به راحتی از طریق کانال مرکزی 46 CMG جابجا شود و باعث جدا شدن هلیکاز شود. پس از مواجهه با ضایعه، سرعت CMG فورا از حدود 300 نوکلئوتید در دقیقه به 30 نوکلئوتید در دقیقه کاهش یافت (شکل 1g,h)، که نشان دهنده جداسازی است. در غیاب PRIMPOL، چنگال های متوقف شده در ضایعه به طور بسیار ناکارآمد (حدود 7٪) دوباره راه اندازی شدند (شکل 1f و داده های توسعه یافته شکل.

1f)، احتمالا از طریق TLS همانطور که قبلا نشان داده شده است 47، 48. در عصاره حاوی 30 نانومتر WT PRIMPOL، حدود 50 درصد چنگال‌های متوقف شده در ضایعه مجددا شروع به کار کردند (شکل 1i,f)، که باعث می‌شود سرعت CMG از حدود 30 نوکلئوتید در دقیقه به 300 نوکلئوتید در دقیقه افزایش یابد که با سرعت چنگال‌های بدون مزاحمت مطابقت دارد (شکل 2b و شکل 1h). نکته مهم این است که چنگال های ضایعه ایست شده به روشی وابسته به PRIMPOL در عصاره حاوی سطوح درون زا Pol α دوباره راه اندازی شدند.

نتیجه می گیریم که WT PRIMPOL انسانی نوترکیب از راه اندازی مجدد چنگال قوی در سنجش تک مولکولی ما با استفاده از دو منبع متعامد RS پشتیبانی می کند (شکل 1f). ما متعاقبا از روش تخلیه Pol α استفاده کردیم زیرا توان عملیاتی بالاتری را ارائه می‌کرد و به راحتی برای سنجش‌های گروهی سازگار بود (به زیر مراجعه کنید).

برای ایجاد یک سنجش گروهی برای راه اندازی مجدد چنگال وابسته به PRIMPOL، ما یک پلاسمید 3 کیلوبایتی را در عصاره تهی شده از Pol-α تکثیر کردیم، که سنتز DNA را در مقایسه با عصاره تهی شده ساختگی به شدت سرکوب کرد (شکل 1j (مقایسه کنید i و ii)). سطوح پایین سنتز DNA در عصاره تهی شده از Pol-α (شکل 1j (ii)) احتمالا ناشی از مقادیر کمی از Pol α است که از تخریب ایمنی فرار کرده است (داده های توسعه یافته شکل 2c).

تکمیل عصاره تهی شده از Pol-α با 3-30 نانومتر WT PRIMPOL منجر به افزایش قابل توجهی در سنتز DNA به روشی وابسته به PRIMPOL شد (شکل 1j,k). از آنجایی که سلول های انسانی حاوی حدود 17 نانومتر PRIMPOL 49 هستند، غلظت های مورد استفاده در اینجا تقریبا فیزیولوژیکی است. قابل ذکر است، 30 نانومولار WT PRIMPOL به طور کامل سنتز DNA را نجات نداد (شکل 1j (v در مقابل i)). ما این را به این واقعیت نسبت می‌دهیم که تخلیه Pol α، نقطه بازرسی آسیب DNA را فعال می‌کند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2c)، که تا حدی از شلیک مبدا جلوگیری می‌کند و منجر به چنگال‌های کمتری می‌شود (داده‌های گسترده شکل 2d (بلات CDC45)).

ما نقش CHK1 را در شکل 4 بازبینی می کنیم.

برای تأیید اینکه PRIMPOL مسئول نجات بخشی از سنتز DNA در سنجش بیوشیمیایی است، ما دو جهش یافته قبلی را آزمایش کردیم: (1) PRIMPOL D114A/E116A (از این پس PRIMPOL(AxA))، که فاقد فعالیت پریماز و پلیمراز است 2، 3. و (2) PRIMPOL D519R/F522A/D551R/I554A (از این پس PRIMPOL(ΔRPA))، که نمی تواند با RPA 30 تعامل داشته باشد (داده های توسعه یافته شکل 1c). سنجش in vitro پریماز-پلیمراز نشان داد که PRIMPOL(ΔRPA) (اما نه PRIMPOL(AxA)) فعالیت کاتالیزوری را نشان می دهد (داده های توسعه یافته شکل 1d).

آزمایش‌های شکنش کروماتین نشان می‌دهد که WT PRIMPOL و PRIMPOL (AxA) (اما نه PRIMPOL (ΔRPA)) برای DNA در عصاره تخلیه‌شده Pol-α (داده‌های گسترده شکل 2d) و در عصاره تیمار شده با APH (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2e) استفاده می‌شوند. برخلاف WT PRIMPOL، نه PRIMPOL (AxA) و نه PRIMPOL (ΔRPA) سنتز DNA در عصاره تهی شده از Pol-α را نجات ندادند (شکل 1j (v-vii))، گزارش‌هایی را تأیید می‌کند که پرایمینگ هم به فعالیت آنزیمی PRIMPOL 1، 4 و هم به تعامل 130، RPA نیاز دارد.

این داده‌ها نشان می‌دهند که عصاره تخلیه‌شده Pol-α، راه‌اندازی مجدد چنگال وابسته به PRIMPOL را بازنویسی می‌کند و یک سیستم مدل قدرتمند برای تشریح مکانیسم مولکولی repriming ارائه می‌کند.

قبلا پیشنهاد شده بود که RPA PRIMPOL را در چنگال های متوقف شده 4 و 30 استخدام کند. از آنجایی که CMGهای جفت نشده، مسیرهای طولانی ssDNA پوشش داده شده با RPA را تولید می کنند، مشخص نیست که PRIMPOL دقیقا کجا به امتداد ssDNA متصل می شود. برای پرداختن به این سوال، WT PRIMPOL (PRIMPOL(WT)-AF647) با برچسب AlexaFluor647 را در عصاره تهی شده از Pol-α تکمیل شده با FEN1-KikG و RPA ذوب شده با mCherry-XL 50، 51 (از این پس RPA-mCherry) (شکل 3xt. این ما را قادر می سازد تا اتصال و تفکیک PRIMPOL، سنتز DNA و میزان RPA-ssDNA را به طور همزمان نظارت کنیم.

نکته مهم این است که برچسب زدن فلورسنت فعالیت راه اندازی مجدد چنگال PRIMPOL را مختل نمی کند (داده های توسعه یافته شکل 3b,c).

در 30 نانومتر PRIMPOL(WT)-AF647، رویدادهای اتصال PRIMPOL بیش از حد روی RPA-ssDNA وجود داشت که حل کردن تک تک مولکول‌ها را غیرممکن می‌کرد. برای تشخیص هر رویداد اتصال PRIMPOL، ما 3 نانومتر PRIMPOL(WT)-AF647 را در 15 ثانیه در هر فریم مشاهده کردیم (شکل 2a). در ابتدا، مسیرهای RPA-ssDNA به صورت دو طرفه بسیار آهسته رشد کردند (شکل 2a و داده های توسعه یافته شکل 3e) - مطابق با هلیکازهای غیر جفت نشده (شکل 1h). پس از راه اندازی مجدد چنگال با واسطه PRIMPOL، مسیرهای RPA-ssDNA به سرعت رشد کردند، اما شدت سیگنال RPA حدود دو برابر کاهش یافت (شکل 2a (پایین)).

این نشان می دهد که PRIMPOL سنتز را فقط روی یک رشته (رشته پیشرو، همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است) دوباره انجام می دهد.

a، کیموگرام ssDNA پوشیده شده با RPA-mCherryXL (سبز) و DNA نوپا پوشیده شده با FEN1-KikG (آبی) در عصاره تهی شده از Pol-α با 3 نانومولار PRIMPOL(WT)-AF647 (ارغوانی) را نشان می دهد. برای وضوح، کیموگرام RPA جدا از FEN1 + PRIMPOL نشان داده شده است. خطوط خاکستری مرز سیگنال RPA را مشخص می کنند: خطوط نقطه چین نشان دهنده CMG های جدا نشده و خطوط بریده نشان دهنده فورک های راه اندازی مجدد هستند. فلش های سفید نشان دهنده راه اندازی مجدد چنگال است. ورودی پایین: مشخصات سیگنال RPA یکپارچه، که پس از راه اندازی مجدد فورک حدود 50 درصد کاهش می یابد.

b، RPA-mCherryXL (سبز)، FEN1-KikG (آبی) و PRIMPOL(WT)-AF647 (ارغوانی) به DNA در عصاره تهی شده از Pol-α متصل می شوند. کارتون ها وضعیت چنگال را در طول زمان نشان می دهند. ج، نمودار احتمال تجمعی PRIMPOL(WT)-AF647 (3 نانومتر) طول مدت رویداد اتصال، مقایسه رویدادهای اتصال چنگال-پرگزیمال (خاکستری تیره) و چنگال-دیستال (خاکستری روشن) در عصاره تخلیه شده از Pol-α (خطوط جامد) یا عصاره تیمار شده با APH (خطوط بریده). مقدار n تعداد رویدادهای الزام آور تحلیل شده را نشان می دهد. d، تعداد تمام رویدادهای اتصال پریمپول فورک-پرگزیمال در واحد زمان در چنگال.

e، تعداد رویدادهای اتصال PRIMPOL دیستال چنگال مشاهده شده در واحد زمان با طول ssDNA در معرض نرمال شده است. در d و e، n مقدار تعداد چنگال ها را نشان می دهد. داده‌ها میانگین ± 95% CI هستند که با راه‌اندازی تخمین زده می‌شوند. f، نمودار احتمال تجمعی رویدادهای اتصال چنگال-پرگزیمال (خطوط جامد) و چنگال-دیستال (خطوط چین خورده) در عصاره تخلیه شده از Pol-α برای PRIMPOL(WT)-AF647 (خاکستری تیره) و PRIMPOL(AxA)-AF647 (نارنجی). مقدار n تعداد رویدادهای الزام آور تحلیل شده را نشان می دهد. داده‌های a - f از آزمایش‌هایی هستند که با 15 ثانیه در هر فریم تصویر شده‌اند.

g، کیموگرام‌هایی که نشان‌دهنده راه‌اندازی مجدد چنگال در عصاره تهی‌شده Pol-α با 3 نانومتر PRIMPOL(WT)-AF647 (ارغوانی) با سرعت 3 ثانیه در هر فریم است. h، نمودار احتمال تجمعی مدت زمان رویداد اتصال PRIMPOL(WT)-AF647 در عصاره تهی شده از Pol-α که در 3 ثانیه در هر فریم تصویربرداری شده است (در این وضوح زمانی، رویدادهای کوتاه مدت بر هر دو گروه فرک-دیستال و چنگال-پرگزیمال غالب هستند). مقدار n تعداد رویدادهای الزام آور تحلیل شده را نشان می دهد. مقادیر P با استفاده از آزمون‌های کولموگروف-اسمیرنوف دو نمونه‌ای دوطرفه (c-f و h) محاسبه شد. *** P < 0.001. همه آزمایش ها دو بار با آماده سازی عصاره های مختلف انجام شد.

ما چندین رویداد اتصال کوتاه مدت PRIMPOL(WT)-AF647 را دور از چنگال‌های تکثیر شناسایی کردیم (شکل 2a (مثلث‌های نارنجی))، که آن‌ها را فورک-دیستال می‌نامیم. بیشتر رویدادهای اتصال پریمپول-دیستال چنگال (~84%) یک فریم (15 ثانیه) یا کمتر (شکل 2c) به طول انجامید و به طور تصادفی در امتداد RPA-ssDNA توزیع شدند. ما همچنین رویدادهای اتصال فورک-پرگزیمال PRIMPOL را نزدیک به چنگال (در 1 پیکسل = 160 نانومتر) شناسایی کردیم، که تمایل به طولانی‌تر از رویدادهای اتصال چنگال-دیستال داشت (شکل 2c). قابل توجه، اتصال طولانی مدت چنگال-پرگزیمال PRIMPOL(WT)-AF647 (شکل 2a,b (براکت های مجعد)) قبل از اکثر رویدادهای راه اندازی مجدد چنگال (~70 ± 10%) بود (شکل.

2a,b (فلش های سفید)).