انتقال پریون گونه های تاو انسانی در مغز موش

تصور می‌شود که اغلب بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی از طریق مکانیسم‌های پریون مانند از طریق مغز پخش می‌شوند، که در آن مجموعه‌های پروتئین رشته‌ای با کاشت قالبی خود تکثیر می‌شوند. ترکیب‌های متمایز رشته‌های آمیلوئید ممکن است پایه فیزیکی سویه‌هایی را که منجر به بیماری‌های مختلف می‌شوند فراهم کند. با این حال، یک ستون اصلی فرضیه پریون، که سویه ها هویت ساختاری خود را پس از انتقال حفظ می کنند، نشان داده نشده است.

در اینجا نشان می‌دهیم که تزریق رشته‌های تاو از مغز افراد مبتلا به بیماری آلزایمر یا دژنراسیون کورتیکوبازال به مغز موش‌های نوع وحشی منجر به مجموعه‌ای از رشته‌های آمیلوئیدی ساخته شده از تاو موش با ساختاری مشابه با ساختار دانه‌ها می‌شود. بنابراین، ما نشان می‌دهیم که مانند سویه‌های پریون، رشته‌های تاو از طریق کاشت قالبی منتشر می‌شوند و این موش یک مدل مناسب برای مطالعه مکانیسم‌های مولکولی است که توسط آن چین‌های تاو متمایز باعث آسیب‌شناسی بیماری‌های خاص در مغز می‌شوند.

توده‌های رشته‌ای پروتئین پریون باعث تخریب عصبی در بیماری‌هایی مانند کورو، بیماری کروتسفلد-جاکوب (CJD)، نوع CJD، انسفالوپاتی اسفنجی‌فرم گاوی، بیماری هدر رفتن مزمن و اسکرپی می‌شوند. اعتقاد بر این است که مجموعه‌های پروتئین پریونی که به اشتباه تا شده‌اند، با کاشت قالبی، خود تکثیر می‌شوند، که به وسیله آن مقادیر کمی از رشته‌ها باعث تا شدن اشتباه پروتئین پریون بومی به رشته‌هایی با همان ترکیب می‌شوند.

این توانایی خود تکثیر زیربنای انتشار پریون در بافت‌ها، بین افراد یک گونه خاص و بسته به شباهت توالی پروتئین پریون، بین افراد گونه‌های مجزا است. ترکیبات مختلف پروتئین پریون باعث ایجاد سویه‌های پریون می‌شود که منجر به زمان‌های انکوباسیون، پروفایل‌های ضایعه و فنوتیپ‌های بالینی متفاوت می‌شود. ساختارهای میکروسکوپ الکترونی کرایو (cryo-EM) رشته‌های پریون نشان داده‌اند که چین‌های آمیلوئیدی متمایز پایه فیزیکی را برای سویه‌های پریون 5، 6، 7، 8، 9 فراهم می‌کنند.

بیش از 20 بیماری نورودژنراتیو توسط مجموعه رشته ای تاو 10 هیپرفسفریله شده تعریف می شود. اکثر موارد بیماری با رشته های تاو فراوان پراکنده هستند و بیماری آلزایمر (AD) شایع ترین تائوپاتی است. جهش در MAPT، ژن کدکننده tau، باعث اشکال ارثی غالب دمانس فرونتوتمپورال با گنجاندن تاو فراوان می‌شود که با تشکیل رشته تاو که باعث تخریب عصبی می‌شود، سازگار است.

ساختارهای Cryo-EM رشته‌های تاو از مغز انسان نشان داده‌اند که چین‌های تاو متمایز نیز بیماری‌های مختلف را مشخص می‌کنند 11 و رشته‌هایی با یک چین تاو در مغز افراد مبتلا به تائوپاتی معین تجمع می‌یابند. علاوه بر این، مقادیر کمی از رشته‌های تاو می‌توانند مونتاژ مونومرهای تاو به‌طور معمول نامنظم را در رشته‌های جدید القا کنند.

پشتیبانی بیشتر برای انتشار پریون مانند تاو با بذر دادن مدل های حیوانی فراهم می شود که در آن رشته های تاو به مغز موش تزریق می شود. رشته ها توسط سلول های مغز در محل تزریق جذب می شوند، پس از آن آسیب شناسی تاو به نواحی دیستال گسترش می یابد، که نشان دهنده انتشار سلول به سلول رشته های تاو در مغز 14، 15، 16، 17، 18، 19 است. بذردهی با تاو مشتق از مغز انسان از تائوپاتی‌های مختلف، ویژگی‌های خاص نوع سلولی آن بیماری‌ها را خلاصه می‌کند.

مطالعات بعدی نشان داد که این اجزاء به طور قوی در مغز موش نوع وحشی 17، 20، 21 و در موش‌هایی که هر شش ایزوفرم تاو مغز انسان را بیان می‌کنند، خلاصه می‌شوند. علاوه بر این، تزریق دانه‌های AD tau به موش‌ها با پلاک‌های آمیلوئید-β فراوان منجر به افزایش قابل‌توجه ادخال‌های تاو در مقایسه با تزریق‌ها به موش‌های نوع وحشی شد.

تزریق رشته‌های مونتاژ شده از تاو نوترکیب به مغز موش‌های نوع وحشی و موش‌هایی که هر شش ایزوفرم تاو مغز انسان را بیان می‌کنند، تأیید کرد که رشته‌های تاو گونه‌های کاشته‌کننده هستند و نشان داد که رشته‌هایی با دانه چین خاص AD بهتر از رشته‌هایی با چین‌خوردگی‌هایی هستند که در مغز انسان مشاهده نشده است.

با این حال، تا کنون نشان داده نشده است که چین‌های تاو با مکانیسم‌های پریون مانند منجر به بیماری‌های متمایز می‌شوند و سویه‌های ساختاری هویت خود را در هنگام انتقال حفظ می‌کنند. توالی‌های انسان و موش در هسته‌های منظم رشته‌های تاو از مغز انسان یکسان هستند، و این نشان می‌دهد که ممکن است هیچ گونه مانعی برای انتقال سویه‌های تاو خاص بیماری انسانی به موش وجود نداشته باشد. اما ساختارهای اتمی رشته‌های تاو که در مدل‌های موش بذری که در بالا توضیح داده شد، ناشناخته باقی مانده‌اند.

تا به امروز، ساختارهای cryo-EM رشته‌های تاو از مدل‌های موش تراریخته با ساختارهای مشاهده‌شده برای رشته‌های استخراج‌شده از مغز انسان متفاوت بوده است. علاوه بر این، تزریق داخل مغزی رشته‌های آلفا-سینوکلئین نوع وحشی نوترکیب به مغز موش‌های تراریخته برای α-سینوکلئین انسانی A53T، اجزایی ایجاد کرد که یادآور موارد آتروفی سیستم چندگانه (MSA) بود، اما ساختار رشته‌های نوترکیب متمایز از رشته‌هایی بود که فقط به طور جزئی در MSA مشاهده شد. دانه ها 27.

در اینجا، ما گزارش می‌کنیم که تزریق داخل مغزی رشته‌های تاو استخراج‌شده از مغز انسان افراد مبتلا به AD یا دژنراسیون کورتیکوبازال (CBD) به موش‌های نوع وحشی منجر به آخال‌های تاو خاص نوع سلولی مشخصه هر دو بیماری می‌شود، و این آخال‌ها شامل رشته‌هایی از ساختارهای درون زا با ساختارهای مشابه موش است. نتایج ما نشان می‌دهد که چین‌های تاو متمایز به‌عنوان سویه‌های پریونی عمل می‌کنند که از طریق کاشت قالبی منتشر می‌شوند و آسیب‌شناسی خاص بیماری را در مغز هدایت می‌کنند.

ما دانه های تاو استخراج شده از قشر پیشانی انسان با AD یا CBD را به جسم مخطط موش های نوع وحشی 6 تا 18 هفته ای تزریق کردیم (شکل 1، روش ها و جداول داده های توسعه یافته 1-3). در 9 ماه پس از تزریق (mpi)، آسیب شناسی تاو بذر با استفاده از آنتی بادی اختصاصی تاو موش (mTau) و آنتی بادی های وابسته به فسفوریلاسیون AT8 و AT100 شناسایی شد که نشان دهنده تجمع تاو موش فسفریله شده است. یک آنتی بادی اختصاصی تاو انسانی (HT7) هیچ رنگ آمیزی نداشت (داده های توسعه یافته شکل 1).

آسیب شناسی تاو AT8 مثبت از محل تزریق به قشر مغز، جسم پینه ای و سایر نواحی مغز برای هر دو نوع دانه گسترش یافته بود، اما توزیع منطقه ای و مورفولوژی پاتولوژی تاو بسته به دانه متفاوت بود (داده های توسعه یافته شکل 2). موش های تزریق شده با دانه های AD پاتولوژی تاو را نشان دادند که به بدن سلول های عصبی و فرآیندهای آنها محدود بود. در مقابل، موش‌هایی که با دانه‌های CBD تزریق شدند، آسیب‌شناسی تاو را در سلول‌های عصبی و سلول‌های گلیال نشان دادند، بدن‌های پیچ‌خورده‌ای را تشکیل دادند و باعث ایجاد آستروسیت‌های پلاک مانند شدند، همانطور که در CBD در انسان مشاهده شد.

این یافته‌ها نشان می‌دهد که ساختار دانه تاو بر روی هدف‌گیری سلولی و مورفولوژی پاتولوژیک در داخل بدن تأثیر می‌گذارد.

مغزهای a، b، AD تزریق شده (a) و CBD تزریق شده (b) با آنتی بادی های AT8، AT100، mTau و GT-38 ایمونوهیستوشیمی شده اند. رنگ آمیزی شده با نقره Gallyas–Braak (سیاه)؛ و فلورسانس دوگانه با AT8 (قرمز) و Olig2 (سبز) رنگ آمیزی شد. رنگ آمیزی DAPI به رنگ آبی نشان داده شده است. تصاویر بزرگ‌نمایی شده قشر حرکتی مکمل را در سطح پشتی میانی قشر پیشانی نشان می‌دهند. تصاویر رنگ آمیزی فلورسانس جسم پینه ای را نشان می دهد. میله های مقیاس، 100 میکرومتر (a، b).

رنگ‌آمیزی با GT-38، آنتی‌بادی که انکلوزیون‌های تاو را در AD تشخیص می‌دهد اما در تائوپاتی‌های سه تکراری (3R) - فقط یا چهار تکراری (4R) -29 منفی است، در موش‌هایی که دانه‌های AD تزریق شده‌اند مثبت بود، اما در موش‌هایی که دانه‌های CBD تزریق شده بودند منفی بود. Immuno-EM با GT-38 همچنین برای رشته‌های نوترکیب با چین AD که منحصرا از تاو 3R ساخته شده‌اند منفی بود، اما برای رشته‌های دارای تای انسفالوپاتی تروماتیک مزمن (CTE) که منحصرا از تاو 4R یا چین‌های AD متشکل از مخلوطی از تاو 3R و 4R تشکیل شده است مثبت بود (شکل 3).

این یافته ها نشان می دهد که اپی توپ آنتی بادی GT-38 در دومین تکرار اتصال به میکروتوبول (R2) قرار دارد که در 3R tau وجود ندارد. از آنجایی که موش‌ها منحصرا 4R تاو را در مغز بالغ بیان می‌کنند، این نتایج با این فرضیه مطابقت دارد که اپی توپ در R2 برای اتصال GT-38 در رشته‌های مغز موش تزریق شده با دانه‌های تاو AD قابل دسترسی است، اما همان اپی توپ در رشته‌های موش‌های تزریق شده با قسمت‌های هسته‌ای از CBD قابل دسترسی نیست.

وسترن بلات فراکسیون های نامحلول در سارکوزیل از مغز موش تزریق شده برای mTau مثبت و برای HT7 منفی بود، که نشان می دهد که بخش های نامحلول تنها از تاو موش تشکیل شده است، در توافق با ایمونوهیستوشیمی شرح داده شده در بالا. نوارهای مجزا با آنتی‌بادی‌های T46 و AT8 تفاوت‌های بیوشیمیایی را بین تاو نامحلول بذر شده با AD یا CBD tau نشان می‌دهند. نکته قابل توجه، کاشت با CBD tau منجر به باند 37 کیلو دالتون شد که مشخصه آسیب شناسی CBD است (شکل 2).

Immuno-EM با آنتی‌بادی‌های mTau و AT8 از فراکسیون‌های نامحلول در سارکوزیل تأیید کرد که این بخش‌ها حاوی رشته‌هایی هستند که از تاو موش فسفریله شده‌اند. رشته های تاو از مغز موش تزریق شده با دانه های CBD، فواصل متقاطع بیشتری نسبت به مغزهای تزریق شده با دانه های AD داشتند (شکل 2).

یک، وسترن بلات فراکسیون های نامحلول در سارکوزیل از نیمکره های مغز با استفاده از آنتی بادی های T46 و AT8 تجمع تاو نامحلول موش را با سرعت 9 mpi و 12 mpi برای موش های نوع وحشی تزریق شده با دانه های AD و CBD نشان می دهد. b، میکروسکوپ الکترونی رنگ‌آمیزی منفی با برچسب‌گذاری immunogold موش‌های تزریق شده با AD و CBD 12 mpi با آنتی‌بادی‌های mTau و AT8. نوار مقیاس، 25 نانومتر (b).

برای از بین بردن بیشتر احتمال دست نخورده ماندن رشته‌های تاو انسانی تزریق‌شده در طول آزمایش‌های کاشت، ما با استفاده از رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی، میکروسکوپ الکترونی و وسترن بلات، آنالیز دوره‌ای از دانه‌های تزریق‌شده را انجام دادیم. دانه‌های تاو انسانی بلافاصله پس از تزریق با رنگ‌آمیزی قابل مشاهده بودند، اما بعد از 1 هفته دیگر قابل تشخیص نبودند. AT8، pFTAA و رنگ‌آمیزی نقره Gallyas-Braak در موش‌هایی که دانه‌های CBD با سرعت 1 mpi و در موش‌هایی که دانه‌های AD با سرعت 3 mpi تزریق شده بودند، آخال‌های تاو را نشان داد.

در موش‌های تزریق‌شده با AD و CBD، تعداد تاو به ترتیب 6 mpi و 9 mpi افزایش یافته بود (داده‌های توسعه یافته شکل 4). پاکسازی دانه های انسانی تزریق شده و افزایش وابسته به زمان در آخال های تاو موش با میکروسکوپ الکترونی رنگی منفی و وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های ضد تاو C، mTau و AT8 تایید شد (داده های توسعه یافته شکل 5).

تجزیه و تحلیل Cryo-EM رشته‌های تاو استخراج‌شده از مغز موش‌هایی که با دانه‌های AD یا CBD تزریق شده بودند، نشان داد که رشته‌های تاو موش بذری همان ساختار دانه‌های انسان را دارند (شکل 3، جدول داده‌های توسعه‌یافته 4 و داده‌های توسعه‌یافته شکل 6). در موش‌های تزریق شده با دانه‌های AD، بیشتر رشته‌ها (83%) رشته‌های مارپیچی جفتی (PHFs) بودند، که برای آن بازسازی به وضوح 3.6 Å محاسبه شد. این ساختار (با انحراف میانگین مربع ریشه برای همه اتم‌های غیرهیدروژن 0.906 Å) با چین‌های آلزایمر از مغزهای AD 30، 31 یکسان بود.

ما نتوانستیم برای رشته‌های باقی‌مانده (17%) بازسازی به دست آوریم، که میانگین‌های کلاس دوبعدی (2D) را نشان داد که یادآور تک رشته‌ها یا رشته‌های مستقیم از AD بود (داده‌های توسعه‌یافته شکل 6b). تصاویر Cryo-EM از مغز موش تزریق شده با دانه‌های تاو CBD حاوی دو نوع رشته بود: 74 درصد از رشته‌ها از یک تک رشته و 26 درصد از رشته‌ها از دو پروتوفیلامنت یکسان ساخته شده بودند. ما تک‌ها را با وضوح 3.4 Å بازسازی کردیم.

این ساختار (با ریشه میانگین انحراف مربع برای همه اتم های غیر هیدروژن 0.576 Å) با رشته های CBD نوع I انسانی 32 یکسان بود. بازسازی دوتایی ها، با وضوح 10 Å، نشان داد که آنها ممکن است رشته های CBD نوع II باشند.

a، مقطع کریو-EM رشته‌های تاو موش تزریق شده با دانه‌های AD و CBD عمود بر محور مارپیچ، که هر کدام یک پله را نشان می‌دهند. نوارهای مقیاس، 5 نانومتر. b، مدل اتمی در نقشه چگالی cryo-EM (شفاف خاکستری) رشته‌های تاو موش AD- (بالا، آبی) و CBD تزریق شده (پایین، نارنجی) قرار گرفته است. ج، پوشش ستون فقرات C-alpha رشته‌های تاو موش AD- (بالا، آبی) و CBD تزریق شده (پایین، نارنجی) با PHFهای AD ex vivo انسان و رشته‌های CBD نوع I (خاکستری).

ساختارهای AD و CBD مربوطه با یک ریشه میانگین انحراف مربع برای همه اتم های غیر هیدروژن 0.906 و 0.576 Å همپوشانی دارند.

ما شواهدی برای انتقال پریون گونه‌های تاو بیماری خاص انسانی در مغز موش ارائه می‌کنیم. از آنجایی که توالی‌های تائو موش و انسان در هسته‌های مرتب چین‌های رشته‌ای AD و CBD یکسان هستند، تاو موش به رشته‌هایی با ساختارهای اتمی مشابهی که از مغز انسان می‌رسد، جمع می‌شود. مطابق با مشاهدات قبلی 15، 17، 21، 22، و حمایت از این فرضیه که چین های تاو متمایز نشان دهنده سویه های منحصر به فرد هستند، تزریق دانه های تاو مشتق شده از مغز انسان منجر به ضایعات خاص نوع سلولی در مغز موش شد که مشخصه AD و CBD است.

پیوند جایگزین رونوشت MAPT منجر به بیان شش ایزوفرم تاو در مغز انسان بالغ می شود، با سه ایزوفرم شامل سه تکرار اتصال به میکروتوبول (3R) و سه ایزوفرم شامل چهار تکرار (4R) 33. تائوپاتی‌های انسانی بر اساس ترکیب ایزوفرم رشته‌هایشان طبقه‌بندی می‌شوند: مخلوطی از هر شش ایزوفرم در تائوپاتی‌های 3R + 4R مانند AD جمع می‌شوند، تنها 3R تاو در تائوپاتی‌های 3R مانند بیماری Pick و تنها 4R تاو در تائوپاتی‌های 4R مانند تائوپات‌های 4R جمع می‌شوند.

از آنجایی که موش های بالغ تنها 4R tau را بیان می کنند، عدم وجود 3R tau نشان دهنده یک مانع گونه ای برای انتقال دانه های تاو با چین Pick است. این مانع برای تائوپاتی های 3R + 4R و 4R اعمال نمی شود. بنابراین، دانه‌های تاو از سایر تائوپاتی‌های 3R + 4R و 4R، مانند CTE و فلج فوق هسته‌ای پیشرونده، ممکن است در موش‌های نوع وحشی نیز منتقل شوند.

روش دیگر، موش‌هایی که هم 3R و هم 4R تاو 34 موش را بیان می‌کنند یا موش‌هایی که هر شش ایزوفرم تاو مغز انسان را در غیاب تاو 22، 35، 36 درون‌زای موش بیان می‌کنند، می‌توانند برای انتقال دانه‌ها از تمام تائوپاتی‌های انسانی استفاده شوند، و این موش‌ها آسیب‌شناسی گسترده‌تری نسبت به تاو تیپ 2-4 از خود نشان می‌دهند.

با وجود شباهت ها در نحوه انتشار سویه های تاو و پریون، تفاوت های مهمی بین این دو پروتئین وجود دارد. بیماری های پریون عفونی هستند و می توانند بین افراد منتقل شوند، در حالی که انتقال بین فردی تائوپاتی ها گزارش نشده است (اگرچه AD ایتروژنیک در دریافت کنندگان هورمون رشد مشتق شده از هیپوفیز جسد که حاوی دانه های AD است گزارش شده است 37). باید دید که آیا تجویز محیطی دانه‌های تاو می‌تواند باعث تخریب عصبی شود یا خیر. بیماری های پریون نیز معمولا بسیار سریعتر از تائوپاتی ها پیشرفت می کنند.

بنابراین، موش‌هایی که دانه‌های پریون تزریق می‌شوند می‌توانند به بیماری شدید مبتلا شوند، در حالی که موش‌هایی که دانه‌های تاو تزریق می‌کنند، علی‌رغم وجود آخال‌های تاو در مغز سالم به نظر می‌رسند. ممکن است موش‌هایی که دانه‌های تاو تزریق می‌کنند به اندازه کافی عمر نکنند که علائم را ایجاد کنند، یا اینکه میزان انکلوژن‌های تاو که در این موش‌ها ایجاد می‌شود برای ایجاد علائم بالینی کافی نباشد. بنابراین ناشناخته باقی می ماند که آیا تکثیر بذر تاو و سمیت پایین دست در دو فاز جداگانه اتفاق می افتد، همانطور که برای پریون ها پیشنهاد شده است 38 .

موش‌هایی که برای تاو انسانی تراریخته هستند با جهش‌هایی که باعث زوال عقل فرونتومپورال می‌شوند، خود به خود رشته‌های تاو فراوانی تشکیل می‌دهند و دچار تخریب شدید عصبی می‌شوند. علاوه بر این، ماکاک های رزوس تزریق شده با دانه های تاو از مغز افراد مبتلا به فلج فوق هسته ای پیشرونده تائوپاتی 4R، 6 ماه پس از تزریق دانه دچار اختلالات حرکتی و رفتاری شدند.

مونتاژ رشته را می توان به سه مرحله جدا کرد. مرحله اول شامل جذب دانه است که ممکن است گیرنده های سطح سلولی 13، 44، 45 را درگیر کند و احتمالا تحت تأثیر اندازه رشته های تاو و خواص سطحی آنها، از جمله وجود یا عدم وجود پوشش فازی است. مرحله دوم شامل جذب و تبدیل قالبی تاو مونومری در سلول گیرنده 46 است.

این مرحله به سازگاری بین دانه، بستر تاو مونومری، از جمله اصلاحات پس از ترجمه آن، و محیط نوع سلولی نیاز دارد، که ممکن است شامل کوفاکتورهایی باشد که برای مونتاژ رشته ضروری هستند یا نباشند. در طی این مرحله، دانه‌های تاو انسانی به تدریج ناپدید می‌شوند، که نشان می‌دهد که قالب‌بندی و پاکسازی وفادار دانه‌های تاو در سلول‌های مغز همزمان اتفاق می‌افتد. مرحله سوم و آخر رهاسازی رشته های تازه تشکیل شده و جذب آنها توسط سلول های متصل است که منجر به گسترش کلیشه ای پاتولوژی تاو از طریق نواحی متصل مغز می شود 47 .

چین‌های تاو مختلف ممکن است بر یک یا چند مورد از این مراحل تأثیر بگذارند، در نتیجه هم کارایی تکثیر و هم ویژگی نوع سلولی مشاهده‌شده در تائوپاتی‌ها را شکل می‌دهند.

شناسایی عوامل مولکولی که جذب تاو، تبدیل قالب و انتشار را تعدیل می‌کنند، برای درک اینکه چگونه سویه‌های تاو مجزا آسیب‌شناسی‌های خاص را به شیوه‌ای پریون مانند منتقل می‌کنند، ضروری است. آزمایش‌های گذر سریال آینده، توصیف کاملی از سویه‌های تاو خاص بیماری را ارائه می‌دهد.

مشاهدات ما مبنی بر اینکه تزریق داخل مغزی موش‌های نوع وحشی با دانه‌های تاو از مغز انسان مبتلا به بیماری‌های عصبی منجر به جمع‌آوری رشته‌های تاو موش می‌شود که ترکیب دانه‌های بیماری خاص انسان را حفظ می‌کنند، نشان می‌دهد که موش مدل مناسبی برای بررسی این مکانیسم‌ها است. این توضیح منجر به درک بهتر رفتار سویه تاو مخصوص بیماری می شود و راه های تشخیصی و درمانی جدیدی را ارائه می دهد.

فراکسیون های نامحلول در سارکوزیل از مغز پنج فرد مبتلا به AD تایید شده از نظر آسیب شناسی عصبی و شش فرد مبتلا به CBD تهیه شد (جدول داده های توسعه یافته 1). گلوله های حدود 0.5 گرم نمونه مغز با 2 میلی لیتر سالین استریل شسته شدند و به دنبال آن اولتراسانتریفیوژ همانطور که شرح داده شد 48 انجام شد. سپس گلوله ها در 120 میکرولیتر سالین استریل با استفاده از دستگاه سونیکاتور شاخ فنجانی (Sonifier SFX، برانسون) با قدرت 35 درصد به مدت 180 ثانیه سونیکا شدند (مرجع 49). اینها دانه های AD و CBD بودند که برای تزریق استفاده می شدند. رضایت آگاهانه از افرادی که مغز خود را برای مطالعه اهدا کردند، اخذ شد.

بافت مغز انسان با مجوز از هیئت های بازبینی اخلاقی موسسات و بیمارستان های مربوطه استفاده شد.

از موش‌های نوع وحشی (6 تا 18 هفته) استفاده شد (جدول داده‌های توسعه‌یافته 2 و 3 برای تعداد موش‌های مورد استفاده را ببینید؛ هیچ ملاحظات آماری برای تعیین حجم نمونه استفاده نشد و در طراحی این مطالعه از تصادفی‌سازی استفاده نشد). آنها تحت شرایط استاندارد با دسترسی آزادانه به غذا و آب قرار گرفتند. تحت بیهوشی ایزوفلوران، موش‌های نر C57BL/6J (Japan SLC) در یک قاب استریوتاکسیک ثابت شدند و با 3 میکرولیتر یا 5 میکرولیتر دانه به صورت دو طرفه به جسم مخطط تزریق شدند (مختصات از برگما: 0.5± میلی‌متر قدامی، 2.0 ± میلی‌متر 3.0 میلی‌متر از دور میلی‌متر و با استفاده از حلقه‌های 0.0 میلی‌متر بر میلی‌لیتر).

پس از تزریق، حیوانات به قفس خود بازگردانده شدند و 9 تا 12 ماه بعد آنالیز شدند. برای cryo-EM، دو مغز موش که با دانه‌های تاو AD یا CBD تزریق شده بودند، ادغام شدند. تمام پروتکل‌های آزمایشی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات مؤسسه علوم پزشکی متروپولیتن توکیو تأیید شد.