تاریخچه ایمنی نوع 2 ماکروفاژهای ریه را برای تحمل بیماری های ویروسی آموزش می دهد

بیماری ویروسی تنفسی شدید به طور گسترده ای در بین افراد متفاوت است و اغلب منعکس کننده آسیب شناسی ایمنی به جای کنترل ناکافی پاتوژن است، که نشان می دهد سابقه ایمنی قبلی می تواند ریه ها را به سمت تحمل بیماری سوق دهد. در اینجا نشان می‌دهیم که ماکروفاژهای مرتبط با عصب و راه هوایی (NAMs)، زیر مجموعه‌ای از ماکروفاژهای بینابینی، پس از التهاب نوع 2 ناشی از Nippostrongylus brasiliensis، به‌طور زودگذر گسترش می‌یابند.

بنابراین ما فرض کردیم که NAM ها ایمنی آموزش دیده اپی ژنتیکی را به دست می آورند و این را با استفاده از یک مدل چالش هترولوگ آزمایش کردیم که در آن موش هایی که قبلا با N. brasiliensis آلوده شده بودند، 4 تا 6 هفته بعد با آنفولانزای کشنده H1N1 به چالش کشیده شدند. همه موش های N. brasiliensis شرطی شده جان سالم به در بردند، در حالی که همه گروه های کنترل بدون شرط در روزهای 5-6 تسلیم شدند. حفاظت بدون کاهش بار ویروسی یا افزایش پاسخ‌های سلول T رخ داد، در عوض با کاهش آسیب‌شناسی ایمنی، تقویت نشانه‌های نوع 2، افزایش افروسیتوز و تسریع ترمیم بافت ردیابی شد.

با استفاده از موش‌های NAM-DTR، نشان می‌دهیم که NAM‌های شرطی برای محافظت لازم و کافی هستند: تخلیه یا جایگزینی با NAM‌های غیرشرطی بقا را لغو کرد، در حالی که انتقال پذیرفته‌شده NAM‌های شرطی تحمل را بدون افزایش پاکسازی ویروسی ایجاد کرد. آنالیزهای ژنومی یک برنامه کروماتین IL-4-STAT6-PPARγ و ARG1 را دخیل می‌کند که یک حالت پیش‌برنده و ترمیمی NAM باعث ترمیم بافت، ایمنی نوع 2 و افروسیتوز در طول عفونت‌های ویروسی تنفسی کشنده می‌شود.

در نهایت، متاآنالیز اطلس‌های تک سلولی ریه انسان از گروه‌هایی از افراد سالم و افراد مبتلا به IPF و COPD، برنامه‌های تعمیر NAM-مانند وابسته به زمینه را نشان داد. این یافته ها ایمنی آموزش دیده محلی را در ماکروفاژهای ساکن ریه به عنوان مکانیزم تحمل بیماری و نقطه ورود درمانی برای عفونت های تنفسی التهابی شدید ایجاد می کند.

یک پاسخ ایمنی موثر نیاز به متعادل کردن سیگنال‌های پیش التهابی و تنظیمی دارد، وظیفه‌ای که توسط ماکروفاژهای ساکن بافت (RTM) در اوایل عفونت انجام می‌شود. در ریه ها، RTM ها به ماکروفاژهای آلوئولی (AMs) یا ماکروفاژهای بینابینی (IMs) 1، 2، 3 اشاره دارند. IMها شامل زیرمجموعه‌های عملکردی متمایز هستند که توسط نشانگرهایی مانند CD169، CX3CR1، CD206، LYVE1 و MHCII 3، 4، 5 و بیان کموکاین 6 تعریف شده‌اند.

ما یک زیرمجموعه CD169 + IM را شناسایی کردیم که در اطراف راه‌های هوایی و اعصاب ریوی بزرگ در موش‌ها و انسان‌ها به نام IMs مرتبط با عصب و راه هوایی (NAMs) قرار داشت که برنامه‌های ترمیم زخم، تنظیم ایمنی و افروسیتوز را بیان می‌کند. بر خلاف AM ها که پس از آنفولانزا یا عفونت SARS-CoV-2 دچار مرگ سلولی قابل توجهی می شوند، NAM ها در اوایل گسترش می یابند 3، 7، که نشان می دهد ممکن است تحت تغییرات اپی ژنتیکی قرار گیرند تا نشانه های ایمنی آموزش دیده را به دست آورند.

ایمنی آموزش دیده برنامه ریزی مجدد بادوام سلول های ذاتی از طریق سیم کشی مجدد متابولیک و بازسازی اپی ژنتیک پس از یک محرک اولیه 8، 9، 10، 11 است. بیشتر کارها بر روی تمرین مرکزی متمرکز شده است، که در آن تغییرات اپی ژنتیکی در پیش سازهای مغز استخوان (BM) مونوسیت ها، ماکروفاژها و نوتروفیل ها را دوباره سیم کشی می کنند تا مقاومت ضد میکروبی را افزایش دهند، که معمولا کنترل پاتوژن را بهبود می بخشد 12، 13، 14، 15، 16.

در مقابل، شواهدی مبنی بر ایمنی آموزش دیده محلی در ماکروفاژهای ساکن که عمدتا از طریق تحمل بیماری با محدود کردن آسیب شناسی ایمنی به جای کاهش بار پاتوژن محافظت می کند، محدود است. تحمل بیماری با مقاومت متفاوت است زیرا آسیب ناشی از سیستم ایمنی را بدون تأثیر بر بار پاتوژن مهار می کند 17، 18، 19، 20. با این حال، تشریح تحمل بیماری ذاتا چالش برانگیز است زیرا نیازمند جداسازی مکانیسم‌های محافظ بافت از اثرات بر پاکسازی پاتوژن است.

در اینجا ما بررسی کردیم که آیا NAM ها می توانند ایمنی آموزش دیده محلی را برای ارتقاء تحمل بیماری در طول عفونت ویروسی تنفسی کشنده به دست آورند. ما یک مدل عفونت تنفسی هترولوگ را با تلقیح موش‌ها با انگل‌های N. brasiliensis ایجاد کردیم، به موش‌ها به مدت 4 تا 5 هفته استراحت دادیم و سپس آنها را با دوز کشنده آنفلوانزا به چالش کشیدیم. ما نشان می‌دهیم که تاریخچه ایمنی نوع 2 می‌تواند حالتی بادوام و آموزش‌دیده محلی را در NAM ها حک کند که ریه را به سمت تحمل بیماری در طی چالش ویروسی شدید تنفسی بعدی تغییر می‌دهد.

این برنامه ماکروفاژ محور، تنظیم ایمنی را با رفع التهاب و ترمیم بافت به منظور محدود کردن آسیب شناسی ایمنی و حفظ عملکرد میزبان ترکیب می کند و آموزش ماکروفاژهای ساکن بافت را به عنوان مکانیزمی ایجاد می کند که از طریق آن تجربه ایمنی قبلی نتایج عفونت را شکل می دهد. با هم، یافته‌های ما NAMها را به‌عنوان یک گره سلولی کلیدی قرار می‌دهند که از طریق آن تاریخچه ایمنی، انعطاف‌پذیری مخاط را کالیبره می‌کند، و آنها شرطی‌سازی ماکروفاژها را به‌عنوان یک استراتژی درمانی بالقوه برای ارتقای تحمل در عفونت‌های شدید تنفسی و سایر بیماری‌های التهابی ریوی برجسته می‌کنند.

ما مطالعه خود را با تعیین اینکه چگونه زیر مجموعه های مختلف ماکروفاژ ساکن ریه به عفونت N. brasiliensis پاسخ می دهند آغاز کردیم. با استفاده از فلوسایتومتری، ما سینتیک AMs و NAMs را به مدت 5 هفته پس از آلودگی با 600 لارو L3 N. brasiliensis در موش‌های نوع وحشی (WT، C57BL/6) ارزیابی کردیم. ما دریافتیم که فرکانس AMs (از کل RTMs: MerTK + CD64 + F4/80 بالا) کاهش یافته و تا روز 35 افزایش یافته است (داده های توسعه یافته شکل 1a)، در حالی که NAM ها در طول 3 هفته اول تحت یک انفجار پرولیفراتیو قرار گرفتند و سپس تا روز 35 به خط پایه بازگشتند (شکل 1 انتهایی).

عفونت brasiliensis ممکن است NAM ها را آموزش دهد و آنها را برای پاسخ محافظتی در عفونت های بعدی آماده کند.

برای آزمایش این، ما از یک مدل عفونت هترولوگ استفاده کردیم که در آن موش‌ها با حدود 600 لارو L3 N. brasiliensis آلوده شدند، به مدت 4 هفته استراحت کردند و متعاقبا با دوز کشنده ویروس آنفولانزای H1N1، به‌ویژه سویه A/Puerto Rico/8/34 (شکل 18.18) مواجه شدند. موش هایی که قبلا با N. brasiliensis آلوده شده بودند به عنوان موش های آموزش دیده و موش هایی که آلوده نشده بودند به عنوان موش های کنترل تعیین شدند.

ما مشاهده کردیم که موش‌های کنترل بیش از 20 درصد از وزن کل بدن خود را در هفته اول پس از چالش PR8 از دست دادند، در حالی که موش‌های آموزش دیده کاهش وزن کمتری را تجربه کردند و به سرعت تا 8 روز پس از چالش ویروسی به وزن اولیه خود بازگشتند (شکل 1b)، که آنها را از مرگ و میر محافظت می‌کند. قابل‌توجه، همه موش‌های کنترل نشده به نقطه پایان بالینی رسیدند (شکل 1c).

آسیب شناسی ناخالص ریه در 6 روز پس از عفونت (d.p.i.) نشان داد که ریه های موش های آموزش دیده سالم به نظر می رسد و علائم بهبودی کامل را نشان می دهد، در حالی که ریه های موش های آموزش ندیده آسیب شدید ریه، از جمله ذات الریه، آسیب عروقی و خونریزی را نشان می دهد (شکل 1). برای تعیین اینکه آیا حفاظت منعکس کننده افزایش کنترل پاتوژن است، ما ویروس عفونی را کمی کردیم و هیچ تفاوتی بین موش های آموزش دیده و کنترل در 1، 3 یا 6 d.p.i مشاهده نکردیم. (شکل 1e). ما در مرحله بعد پلتیسموگرافی کل بدن (WBP) 23 را روی ساده لوح و N انجام دادیم.

موش‌های برازیلینسیس در روز 35 تمرین کردند تا اطمینان حاصل شود که تمرین N. brasiliensis عملکرد پایه ریوی را تغییر نمی‌دهد. ما روی سرعت تنفس (f)، مکث افزایش‌یافته (Penh)، مکث بازدمی (Tp)، حجم در 50٪ جریان بازدمی (EF50) و سرعت جریان بازدمی اوج (پیک نسبی جریان بازدمی، Rpef) تمرکز کردیم و هیچ تفاوتی بین موش‌های ساده و آموزش دیده پیدا نکردیم (شکل 1f-j). ما در مرحله بعد ریه‌های موش‌های ساده و آموزش دیده را جمع‌آوری کردیم و سپس نمونه‌ها را با استفاده از هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) و تریکروم میسون برای ارزیابی‌های بافت‌شناسی تثبیت کردیم، در پارافین جاسازی کردیم و برش دادیم.

ما هیچ تفاوتی در مورفولوژی یا انفیلتراسیون التهابی مرتبط با آسیب در ریه‌های تمرین‌داده‌ای که شبیه ریه‌های ساده به نظر می‌رسیدند، نیافتیم (داده‌های توسعه یافته شکل 1c,d). برای ارزیابی تفاوت‌ها پس از چالش PR8، بخش‌های H&E را به دو صورت کمی‌سازی کردیم: ابتدا، لوب ریه را به‌عنوان یک ناحیه منفرد 500 میکرومتر ترسیم کردیم و سپس با استفاده از QuPath، تعداد کل هسته‌ها را در ریه‌های کنترل و تمرین‌شده در 6 d.p.i محاسبه کردیم. (داده های توسعه یافته شکل 1e ) و تعداد کل هسته ها را کمی سازی کرد (داده های توسعه یافته شکل.

1f)، در 6 روز پس از چالش آنفولانزا، سلول‌های نفوذی بیشتری را در گروه شاهد در مقایسه با موش‌های آموزش دیده نشان می‌دهد. دوم، ما بر روی راه‌های هوایی در اطراف مناطق 50 میکرومتری تمرکز کردیم و هسته‌های درون هر راه هوایی را برای گروه‌های کنترل آلوده و آموزش‌دیده محاسبه کردیم. تجزیه و تحلیل نرم‌افزار خودکار ما بر روی هسته‌های داخل راه‌های هوایی، نفوذ قابل‌توجهی بیشتری را در کنترل‌های آلوده در مقایسه با گروه‌های آموزش‌دیده آلوده نشان داد (داده‌های توسعه یافته شکل 1g,h).

مدلی برای عفونت هترولوگ موش های C57BL/6J با یا بدون تلقیح زیر جلدی (s.c.) 600 انگل N. brasiliensis مرحله L3، و به دنبال آن یک دوره استراحت 4 تا 5 هفته ای قبل از چالش داخل بینی (i.n.) 150 تخم مرغ (در دوز عفونت 1% ویروس HPR850) در روز 33. b، c، موش‌های کنترل (خطوط سیاه) و N. brasiliensis (خطوط قرمز) به مدت 10 روز پس از چالش PR8 تحت نظر قرار گرفتند و از نظر درصد کاهش وزن (b؛ آزمون U Mann-Whitney، * 0.03 = P) و درصد بقا (c. **0؛ آزمون Kaplan-0 = Me) ارزیابی شدند.

d، تصاویری از آسیب شناسی ناخالص ریه های موش از موش های آلوده در 6 روز پس از چالش PR8. کانون های بیماری (فلش های زرد) نشان داده شده است. n = 5 در هر گروه. e، لیزات کل ریه همگن شدند و تیترهای ویروسی عفونی کل با روش پلاک اندازه گیری شد. PR8 عفونی در موش های کنترل یا N. brasiliensis آموزش دیده در 1، 3 و 6 روز پس از چالش نشان داده شده است (آزمون U Mann-Whitney، n = 5-10 در هر گروه). PFU، واحد تشکیل پلاک. f – j، تحلیل WBP از ساده لوح و N.

موش های آموزش دیده brasiliensis (مانند a) در پارامترهای کلیدی مربوط به تناسب اندام و عملکرد ریه، از جمله f (نفس در دقیقه؛ f). پن (مکث تقویت شده؛ g)؛ Tp (زمان بین تنفس؛ h )؛ EP 50 (زمان لازم برای بازدم 50 درصد نفس؛ i) و Rpef (j). n = 8 در هر گروه. داده ها میانگین ± s.e.m هستند. NS، قابل توجه نیست. k، تصاویری از رنگ‌های تریکروم ماسون روی بخش‌های ریه 5 میکرومتری پارافین جاسازی‌شده در موش‌های کنترل (سمت چپ) و N. brasiliensis (راست) 6 روز پس از چالش PR8. میله‌های مقیاس، 200 میکرومتر (تحریک‌سازی کمتر) و 50 میکرومتر (بزرگ‌نمایی بیشتر).

فلش های فیروزه ای نفوذ سلول های ایمنی را نشان می دهد. فلش های زرد به اپیتلیوم آسیب دیده اشاره می کنند. و فلش های قرمز رسوب کلاژن آبی را نشان می دهد. داده ها نماینده 2 آزمایش هستند (تعداد = 4-10 در هر گروه). شماتیک در a در BioRender ایجاد شد. دامانی-یوکوتا، پ. https://BioRender.com/b88i985 (2026).

رنگ‌آمیزی تریکروم ماسون نشان داد که موش‌های آموزش‌دیده رسوب کلاژن پری برونشیال (شکل 1k (فلش‌های قرمز)) را نشان می‌دهند که مطابق با کلاژن، بازسازی راه هوایی و اختلال در عملکرد ریه است، در حالی که موش‌های آموزش‌دیده تجمع کلاژن کمتری را نشان دادند. ریه های آموزش ندیده همچنین ساختار مزانشیمی و اپیتلیال مختل شده (فلش های زرد)، افزایش خونریزی پری برونشیال و ارتشاح التهابی (فلش های آبی فیروزه ای) و خونریزی و التهاب آلوئولی منتشر را نشان دادند که همه اینها به طور قابل توجهی در موش های آموزش دیده کاهش یافت (شکل 1k).

با هم، این یافته ها نشان می دهد که عفونت قبلی N. brasiliensis آسیب پاتولوژیک ریه را در طول عفونت کشنده PR8 بدون تغییر بار ویروسی محدود می کند.

برای بررسی مکانیسم‌هایی که چگونه تمرین N. brasiliensis محافظت در برابر عفونت ویروسی تنفسی را افزایش می‌دهد، ابتدا تولید سیتوکین ریه را در اوایل پس از چالش PR8 اندازه‌گیری کردیم. از آنجایی که سیتوکین های نوع 2 (مانند IL-4 و IL-13) ترمیم بافت را ارتقا می دهند 24، 25، 26 و فعالیت بیش از حد نوتروفیل ها را سرکوب می کنند 25، 26، ما فرض کردیم که تمرین N. brasiliensis ممکن است منجر به افزایش تولید سیتوکین های نوع 2 در اوایل PR شود.

برای آزمایش این، ما ریه‌های کامل موش‌های کنترل و آموزش دیده را در 24 و 72 ساعت پس از چالش PR8 همگن کردیم و تولید سیتوکین و کموکاین آنها را با استفاده از روش 23-plex Luminex تجزیه و تحلیل کردیم. در مقایسه با موش‌های کنترل، موش‌های آموزش‌دیده تولید به‌طور قابل‌توجهی سیتوکین‌های نوع 2، از جمله IL-4، IL-5، IL-13، IL-3 و IL-9 را در 3 روز پس از چالش PR8 نشان دادند (شکل 2a-e). علاوه بر این، ما ترشح قابل توجهی بالاتری از IL-10 (شکل 2f)، eotaxin-1 (شکل 2g) و MIP-1α (شکل 2h) در موش های آموزش دیده پس از چالش PR8 پیدا کردیم.

افزایش هر دو IL-5 و eotaxin-1 ممکن است افزایش جذب ائوزینوفیل را در ریه های موش های آموزش دیده توضیح دهد. با این حال، تفاوت قابل توجهی در ترشح سایتوکین های التهابی مانند IL-1β یا IFNα پیدا نکردیم (شکل 2i,j).

a-j، آنالیز سیتوکین لیزات ریه در موش‌های کنترل (نوارهای خاکستری، دایره‌ها) و N. brasiliensis (نوار آبی، مربع) در 24 ساعت یا 72 ساعت پس از چالش آنفولانزا با PR8 برای IL-4 (a)، IL-5 (b)، (IL-9)، IL-9 (IL-9) )، IL-10 (f)، eotaxin-1 (g)، MIP-1α (h)، IL-1β (i) و IFNα (j). k – n، آنالیز فلوسیتومتری کل ریه‌ها از موش‌های کنترل WT و N. brasiliensis (آبی) در 3 d.p.i. (نمادهای جامد) یا 6 d.p.i. (نمادهای باز) پس از عفونت 150 EID 50 PR8-IAV.

تعداد کل و فرکانس ها (به عنوان درصد سلول های CD45 +) برای نوتروفیل ها (Ly6G + CD11b + ) (k)، ائوزینوفیل ها (Siglec-F + CD11c - CD11b +) (l)، NAMs (CD169 + Siglec-F + CD11c) - (CD169 + Siglec-F + CD1c) - CD11C نشان داده شده است. و کل سلول‌های CD8a + (چپ)، و درصد سلول‌های CD8 + T (وسط) و NP-TET + سلول‌های CD8a + فعال (راست) (n). داده‌ها دو آزمایش مستقل را نشان می‌دهند (تعداد = 3-5 در هر گروه). داده ها میانگین ± s.e.m هستند. آزمون کروسکال-والیس؛ NS، قابل توجه نیست. * P <0.01، ** P <0.001، *** P <0.0005، **** P <0.0001.

o، تصاویر کانفوکال نشان دهنده مقاطع ریه در 6 d.p.i، که سازماندهی فضایی AMs (سفید، CD169 + Siglec-F +)، NAM های مرتبط با راه هوایی (آبی)، ائوزینوفیل ها (قرمز؛ CD169 - Siglec-F + را نشان می دهد) و محلی شدن را نشان می دهد. IL-5 مرتبط با ائوزینوفیل). میله های مقیاس، 30 میکرومتر (چپ) و 10 میکرومتر (راست). p، کمیت Imaris کل و ائوزینوفیل (EOS) IL-5 کولوکالیزه شده در نزدیکی راه های هوایی بزرگ (3 ریه). داده ها میانگین ± s.e.m هستند. آزمون U Mann–Whitney; * P = 0.03.

q، ارزیابی میزان و محل تشکیل NET بر اساس EPCAM (خاکستری روشن) در امتداد راه‌های هوایی بزرگ (AW)، NAMs (Siglec-F - CD169 +، آبی)، نوتروفیل‌ها (Ly6G، قرمز) و NETs (H3، سبز). میله های مقیاس، 30 میکرومتر. فلش های قرمز راه های هوایی پر از نوتروفیل و NET را نشان می دهد. فلش های زرد نشان دهنده NAM ها هستند. و فلش‌های سفید NAMها را در امتداد راه‌های هوایی بزرگ نشان می‌دهند که از نظر فراوانی و محلی‌سازی در موش‌های آموزش‌دیده و آموزش‌دیده مشابه باقی می‌مانند. r، یکپارچگی اپیتلیال راه هوایی و حفظ مژگان بر اساس رنگ آمیزی EPCAM (خاکستری) و Ac-α-tub (نقاط سبز) ارزیابی شد. میله های مقیاس، 50 میکرومتر.

s، کمیت IMARIS کل Ac-α-tub در موش های کنترل شده با PR8 (به رنگ سبز) و آموزش دیده (فیروزه ای). داده ها میانگین ± s.e.m هستند. n = 3 در هر گروه. * P = 0.05. t، ترمیم و وضوح بافت بر اساس AMs، NAMs، KRT5 (نقاط سبز) و proSP-C (نقاط قرمز) ارزیابی شد. فلش های سفید نشان دهنده NAM ها در امتداد راه های هوایی بزرگ هستند که از نظر فراوانی و محلی سازی مشابه باقی می مانند. میله های مقیاس، 80 میکرومتر. u، کمیت Imaris کل proSP-C از دو آزمایش مستقل نشان داده شده است (n = 3 در هر گروه؛ * P = 0.01).

در مرحله بعد، ما پاسخ‌های ایمنی ذاتی و تطبیقی ​​ریه را در موش‌های کنترل و آموزش دیده با N. brasiliensis در 3 و 6 روز پس از عفونت PR8 با استفاده از فلوسیتومتری چند پارامتری برای شناسایی سلول‌های ایمنی میلوئیدی و تطبیقی ​​مشخص کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 2a,b). تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری در 6 d.p.i. پاسخ های گرانولوسیتی واگرا را پس از چالش ویروسی نشان داد. موش‌های کنترل نوتروفیل‌های بیشتری را جمع‌آوری کردند (Ly6G + CD11b +)، در حالی که موش‌های آموزش‌دیده ائوزینوفیل‌های بیشتری را نشان دادند (CD11b + Siglec-F + CD11c-) (شکل 2k,l).

در مقابل، موش‌های آموزش‌دیده افزایش تعداد AM را نشان دادند (Siglec-F + CD169 + CD11c +) (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a)، که نشان‌دهنده کاهش مرگ AM پس از چالش PR8 در ریه‌های آموزش‌دیده است. ما هیچ تفاوت قابل توجهی در نفوذ به مونوسیت های بالای Ly6C مشاهده نکردیم (داده های توسعه یافته شکل 3b). در نهایت، مطابق با کار قبلی ما که تکثیر NAM قوی پس از عفونت ویروسی را نشان می‌داد، 3، 15، تعداد NAMها هم در موش‌های کنترل و هم در موش‌های آموزش‌دیده پس از چالش PR8 افزایش یافت (شکل 2m)، که پتانسیل تکثیر مشابهی را نشان می‌دهد.

علاوه بر این، ما هیچ تفاوتی در فراوانی یا نسبت سلول‌های B، سلول‌های کشنده طبیعی (NK)، سلول‌های CD4 + T (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3c-e) یا سلول‌های CD8 + T (شکل 2n) در بین دو گروه پیدا نکردیم. ما همچنین هیچ تفاوت آماری در فعال سازی سلول های CD8 + T (CD11a + CD44 + CD62L -) (داده های توسعه یافته شکل 3f) یا سلول های NP-tetramer + CD8 + T (شکل 2n (راست)) پیدا نکردیم. این داده ها در برابر سهم عمده ای از ایمنی تطبیقی ​​به حفاظت مشاهده شده در موش های آموزش دیده N. brasiliensis پس از چالش PR8 استدلال می کنند. در مجموع، نتایج ما نشان می دهد که N.

تهویه brasiliensis یک برنامه ایمنی اولیه نوع 2 را پس از چالش PR8 حفظ می کند، تجمع نوتروفیل ها را کاهش می دهد و معماری ریه را از طریق مکانیسم های عمدتا ذاتی حفظ می کند.

سپس بررسی کردیم که آیا تغییرات متقابل نوتروفیل-ائوزینوفیل شناسایی شده توسط فلوسیتومتری (شکل 2k,l) در سازمان فضایی تغییر یافته در ریه های آلوده منعکس شده است یا خیر. با استفاده از تصویربرداری کانفوکال چند پارامتری از بخش‌های ریه با سرعت 6 روز، ما سه جمعیت میلوئیدی را حل کردیم: NAMs (Siglec-F - CD169 +؛ آبی)، AMs (Siglec-F + CD169 +؛ فلش‌های سفید، سفید)، و ائوزینوفیل‌ها (Siglec-F-CD1 + قرمز).

فراوانی NAM بین گروه‌ها پس از عفونت قابل مقایسه بود، در حالی که ائوزینوفیل‌ها به طور قابل‌توجهی در ریه‌های آموزش‌دیده افزایش یافتند و در نزدیکی NAM‌ها، به‌ویژه در امتداد راه‌های هوایی بزرگ جمع شدند - الگویی که در گروه کنترل وجود نداشت (شکل 2o (ورودی سمت راست)). با توجه به افزایش تولید IL-5 در موش های آموزش دیده (شکل 2b)، ما برای IL-5 رنگ آمیزی کردیم و IL-5 قوی مرتبط با راه هوایی را شناسایی کردیم که عمدتا با ائوزینوفیل ها کلوکالیزه می شد اما عمدتا در ریه های کنترل وجود نداشت.

ما سیگنال‌های IL-5 (سفید) و ائوزینوفیل‌ها (قرمز Siglec-F + CD169-) را اختصاص دادیم و کولوکالیزاسیون ائوزینوفیل را در سطح ماسک‌دار تعیین کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 3g). ریه های آموزش دیده به طور قابل توجهی IL-5 کل و IL-5 مرتبط با ائوزینوفیل را در مقایسه با گروه شاهد افزایش دادند (شکل 2p)، و بیشتر IL-5 + ائوزینوفیل ها در مجاورت NAM ها (آبی) در امتداد راه های هوایی بزرگ قرار گرفتند. این یافته‌ها ائوزینوفیل‌ها را به‌عنوان منبع غالب IL-5 در ریه‌های تمرین‌شده شناسایی می‌کنند و نشان می‌دهند که N.

آموزش برازیلینسیس یک طاقچه راه هوایی منحنی نوع 2 ایجاد می کند که با غنی سازی ائوزینوفیل و تولید موضعی IL-5 مشخص می شود که از افزایش تحمل بیماری به دنبال چالش PR8 پشتیبانی می کند.

به موازات آن، ما تجمع نوتروفیل مشخصی را در موش‌های کنترل پس از عفونت PR8 مشاهده کردیم که با ارتباط بین نوتروفیلی بیش از حد و پیامدهای عفونت ضعیف مطابقت داشت. رنگ آمیزی ایمنی برودگی های ریه در 6 d.p.i. توده‌های نوتروفیل Ly6G + متراکم را در راه‌های هوایی موش‌های کنترل نشان داد، در حالی که ریه‌های تمرین‌شده حاوی نوتروفیل‌های پراکنده بودند (شکل 2q). برای ارزیابی تله‌های خارج سلولی نوتروفیل (NETs)، هیستون H3 (سبز/زرد) را همراه با NAM (CD169 + Siglec-F-؛ شکل 2q (فلش‌های آبی، زرد)) و EPCAM (خاکستری روشن) رنگ‌آمیزی کردیم تا خطوط هوایی را مشخص کنیم.

ریه های کنترل تعداد زیادی نوتروفیل راه هوایی و آلوئولی را با سیگنال مرتبط با NET برجسته نشان دادند (شکل 2q (فلش های قرمز))، ویژگی هایی که عمدتا در ریه های آموزش دیده وجود نداشت. نکته مهم این است که این تفاوت ها بدون تغییرات قابل تشخیص در انفجار پرولیفراتیو NAM پس از عفونت رخ داده است (داده های توسعه یافته شکل 4).