تکامل تنظیم کننده ژن اسکلت انسان

اصلاحات اسکلتی در تکامل انسان نقش اساسی داشت و سازگاری با دوپا، طاق های بزرگ جمجمه و زایمان را امکان پذیر کرد. علیرغم اهمیت آنها، تغییرات ژنتیکی که شکل منحصر به فرد انسان را به وجود آورد، عمدتا ناشناخته باقی مانده است. در اینجا ما به طور سیستماتیک تغییرات تنظیم کننده ژنی را که تکامل اسکلتی انسان را شکل داده است، ترسیم می کنیم. با استفاده از سنجش‌های گزارشگر موازی (MPRAs) در سلول‌های غضروفی، ما 561410 جایگزین مشتق از انسان را در پروموترها و تقویت‌کننده‌ها مورد سنجش قرار دادیم و 15077 جایگاه را با فعالیت تنظیمی خاص انسان شناسایی کردیم.

سپس سلول‌های هیبرید انسان و میمون را تولید کردیم و آنها را به اجداد استخوانی تمایز دادیم. ادغام سلول‌های هیبریدی با اندازه‌گیری‌های MPRA، اطلس‌های ژنوم گسترده‌ای از تغییرات خاص انسان در بیان تنظیم‌کننده سیس و انواع توالی‌ای که آنها را هدایت می‌کنند، ایجاد کرد. این اطلس ها سیم کشی مجدد گسترده ای از ماتریکس خارج سلولی (ECM) را نشان می دهند، از جمله سرکوب قابل توجه بیوسنتز گلیکوزامینوگلیکان (GAG) که منجر به کاهش تقریبا سه تا چهار برابری محتوای GAG مفصلی در انسان در مقایسه با میمون های غیر انسانی می شود.

ما متوجه شدیم که این تغییر ویژه انسان دارای نشانه‌های انتخاب است و احتمالا عاملی کلیدی در حساسیت استثنایی انسان‌ها به بیماری‌های اسکلتی دژنراتیو 3، 4، 5 است. با هم، نتایج ما یک بازسازی هماهنگ تکاملی ECM اسکلتی انسان را نشان می‌دهد و یک چارچوب جامع برای تشریح اساس ژنتیکی زیست‌شناسی اسکلتی انسان ایجاد می‌کند.

انسان ها مجموعه ای منحصر به فرد از فنوتیپ ها دارند که آنها را از سایر میمون های بزرگ متمایز می کند. اسکلت به ویژه نقش محوری در تکامل انسان داشته و ویژگی‌های بارز انسان مانند حرکت دوپا، استخوان‌های باریک و طاق‌های بزرگ جمجمه را تسهیل می‌کند. این ویژگی‌های اسکلتی به خوبی در سطح فنوتیپی 1 مشخص می‌شوند، اما درک ما از تغییرات ژنتیکی که آنها را به حرکت درآورده و آسیب‌شناسی‌هایی که همراه با آنها پدیدار شده‌اند، محدود است.

تصور می‌شود که واگرایی فنوتیپی بین گونه‌های نزدیک به هم عمدتا توسط تغییرات تنظیم‌کننده ژن ایجاد می‌شود (6 و 7). بسیاری از این تغییرات در عناصر cis-regulatory (CREs)، مانند پروموترها و تقویت‌کننده‌ها، که بیان مکانی-زمانی ژن‌های هدف خود را کنترل می‌کنند، رخ می‌دهد. تغییرات تنظیمی سیس به ویژه در تکامل اسکلتی مرکزی هستند زیرا آنها محرک های اصلی واگرایی مورفولوژیکی در نظر گرفته می شوند 8 و 9. بنابراین، برای رمزگشایی مبنای ژنتیکی سازگاری‌های انسانی، بررسی تکامل انسان از طریق لنز سیس-تنظیم ضروری است.

MPRA ها روشی قدرتمند برای اندازه گیری فعالیت تنظیمی سیس هزاران نوع به طور همزمان هستند 10، 11. در MPRAها، یک CRE کاندید (cCRE) در بالادست یک بارکد DNA قابل رونویسی کلون می‌شود، و فراوانی RNA هر بارکد برای اندازه‌گیری بیان ایجاد شده توسط هر توالی استفاده می‌شود (شکل 1a). بنابراین، MPRA ها را می توان برای توصیف انواع زیربنای مقررات واگرا و برای تولید یک اطلس ژنومی از انواع عملکردی استفاده کرد 10، 11.

در مجموع 561410 جایگزین تک نوکلئوتیدی که انسان را از سایر میمون‌های بزرگ متمایز می‌کند و در cCREs 21 قرار می‌گیرد، با سنتز آلل انسانی (مشتق‌شده) و میمون بزرگ (اجدادی) هر cCRE مورد سنجش قرار گرفت و آن‌ها را به سلول‌های غضروفی جنینی انسان معرفی کرد و اثر رونویسی آن‌ها را تعیین کرد. این یک اطلس گسترده ژنومی از اثرات عملکردی هر نوع تنظیمی را که در تکامل انسان بوجود آمد و ثابت شد یا تقریبا ثابت شد به دست داد. ب، همبستگی فعالیت cCRE در تکرارهای بیولوژیکی.

c، تعداد RNA در مقابل تعداد DNA در هر cCRE، به عمق توالی یابی نرمال شده (شمارش در میلیون، CPM). تعداد RNA ها روی 300000 محدود شده است. d، نمودارهای جعبه‌ای که فعالیت (انحراف مطلق میانه، MAD) کنترل‌های مثبت (1404=n)، کنترل‌های منفی (غیرفعال، n=961؛ درهم، n=1051؛ و غیرصفحه‌ای، n=759) و توالی‌های تست cCRE را نشان می‌دهد (4، 0=7، غیر فعال، 557,093). مقادیر روی 30 محدود شده است. نمودارهای جعبه، میانه (مرکز)، چارک دوم و سوم (مرزهای جعبه) و حداقل و ماکزیمم را در 1.5× محدوده بین چارکی (سبیل) نشان می دهد.

نقاط فراتر از این سبیل ها به صورت جداگانه ترسیم می شوند. e، تابع توزیع تجمعی تجربی، نشان‌دهنده همپوشانی cCREها با علامت‌های کروماتین فعال غضروفی 21، و کروماتین باز (ATAC-seq). cCRE های با فعالیت بالاتر همپوشانی بیشتری با ویژگی های کروماتین فعال نشان می دهند. f، نمودار پراکندگی آلل انسان در مقابل میمون بزرگ cCREهای غیر فعال (خاکستری)، فعال اما غیرمتمایز فعال (صورتی) و فعال متفاوت (بنفش). مقادیر در امتیاز MAD = 20 محدود شده است.

g، نمودار فعالیت افتراقی آتشفشان انسان در مقابل آلل میمون بزرگ برای همه cCRE ها با 50 یا بیشتر DNA خوانده شده است.

ما قبلا از MPRA برای بررسی 14042 جایگزینی استفاده کردیم که انسان‌های مدرن را از نئاندرتال‌ها و دنیسوواها جدا می‌کند. MPRA ها همچنین برای بررسی تکامل عمیق تر هومینین استفاده شده اند. یعنی واگرایی بین انسان ها و میمون های بزرگ دیگر 10، 11. این مطالعات کمک‌های مهمی به درک ما از واگرایی انسانی کرده‌اند، اما - به استثنای یک گزارش 13 - بیشتر بر انواع سلول‌های عصبی یا کلاس‌های محدودی از مکان‌ها (مثلا نواحی شتاب‌دار انسان) تمرکز کرده‌اند که نشان‌دهنده بخش کوچکی از تغییرات تکاملی است.

جانشین‌های مشتق شده از انسان، که احتمالا به فنوتیپ‌های خاص انسان کمک می‌کنند، و در برخی موارد ممکن است از طریق انتخاب مثبت به تثبیت رسیده باشند، مورد توجه خاص هستند. با این حال، اثرات عملکردی آنها تاکنون به طور سیستماتیک مورد مطالعه قرار نگرفته است. در نتیجه، اکثریت قریب به اتفاق انواعی که انسان ها را از نزدیک ترین خویشاوندانشان متمایز می کنند، بی خاصیت باقی می مانند.

برای بررسی اثرات نظارتی جانشین‌های مشتق شده از انسان ثابت یا تقریبا ثابت، ما کتابخانه‌ای از 732804 دنباله طراحی کردیم که آلل انسان و میمون بزرگ هر cCRE را در بر می‌گرفت و فعالیت آن‌ها را با استفاده از MPRAs مورد سنجش قرار دادیم. ما این کتابخانه را به سلول‌های غضروفی معرفی کردیم، یک نوع سلول که برای رشد و نگهداری اسکلتی مهم است. کندروسیت ها با تشکیل داربست اسکلتی در طول رشد، نقش محوری در مورفوژنز اکثر استخوان ها دارند.

آنها همچنین نوع سلول ساکن غالب در غضروف بالغ باقی می مانند، جایی که خواص مکانیکی مانند ویسکوزیته را تعیین می کنند. با استفاده از این رویکرد، ما 15077 cCRE را شناسایی کردیم که فعالیت نظارتی ویژه انسان را نشان می‌دهند. برای پیوند دادن این اثرات در سطح توالی به تنظیم سطح ژن، سلول‌های پیش‌ساز هیبریدی استئوکندرال هیبریدی انسان-شمپانزه و انسان-گوریل (سلول‌های مرکب 14) تولید کردیم، که در آن ژنوم انسان و میمون غیرانسانی در معرض یک محیط ترانس مشترک قرار می‌گیرند و امکان جداسازی مشارکت‌های تنظیم‌کننده سیس را از محیط ترانس تنظیم می‌کنند.

این پلتفرم‌های مکمل با هم، واگرایی انسانی گسترده‌ای را نشان می‌دهند که بر ECM تأثیر می‌گذارد، با پیامدهای احتمالی برای مورفولوژی، عملکرد و بیماری اسکلتی انسان.

انواعی که در دودمان انسانی پدید آمدند و به تثبیت رسیدند، اما در دیگر میمون‌های بزرگ وجود ندارند، کاندیدای اصلی برای هدایت صفات خاص انسان هستند، و برخی به طور بالقوه با انتخاب مثبت به تثبیت هدایت می‌شوند. برای شناسایی چنین گونه‌هایی، ما ژنوم‌های 139 میمون بزرگ غیرانسانی (10 بونوبو، 59 شامپانزه، 43 گوریل و 27 اورانگوتان که از این به بعد میمون‌های بزرگ نامیده می‌شوند) را بررسی کردیم و موقعیت‌هایی را شناسایی کردیم که ژنوم همه میمون‌های بزرگ در آن‌ها متفاوت بود (GRCh3 با ژنوم مرجع انسان).

برای فیلتر کردن موقعیت‌هایی که در انسان‌ها متغیر هستند، ما از 15708 توالی کل ژنوم از gnomAD v.2.1.1 (رجوع 16)، و همچنین از سه ژنوم نئاندرتال با پوشش بالا 17، 18، 19 و یک ژنوم دنیسووان با پوشش بالا 20 استفاده کردیم. ما فقط انواعی را انتخاب کردیم که 100٪ در همه این ژنوم‌های انسانی ثابت هستند، که احتمالا قبل از انشعاب بین دودمان انسان مدرن و باستانی پدیدار شده‌اند. در نهایت، ما لیستی را برای انواع موجود در عناصر نظارتی احتمالی، که توسط SCREEN v.2 با استفاده از علامت‌های کروماتین فعال در 839 نوع سلول و بافت انسانی تعریف شده بود، فیلتر کردیم (روش‌ها).

با هم، این کاتالوگی از 561410 گونه تنظیمی نامزد ایجاد کرد که جنس Homo را متمایز می‌کند (شکل 1a) و احتمالا در دوره‌ای پدیدار شد که مشخصه‌ترین فنوتیپ‌های اسکلتی مشتق از انسان - از جمله دوپا، آرواره‌های کوچک و بلوغ استخوانی طولانی‌مدت - در 1 ثبت شد.

برای بررسی سیستماتیک عملکرد تنظیمی انواع کاندید، MPRAهای مبتنی بر لنتی‌ویروس (lentiMPRAs) را با استفاده از غضروف‌های اولیه انسانی مشتق‌شده از غضروف مفصلی جنین انجام دادیم. ما جفت‌هایی از توالی‌های جفت 270 پایه (bp) را که در اطراف هر گونه متمرکز بودند، با یک دنباله برای آلل مشتق شده از انسان و دیگری برای آلل اجدادی میمون بزرگ سنتز کردیم. انواع با فاصله کمتر از 200 جفت باز با هم در یک دنباله گنجانده شدند. به طور کلی، این کتابخانه شامل 561،410 گونه مشتق شده از انسان در 366،402 جفت دنباله (732،804 کل توالی) بود.

هر دنباله به میانه‌ای از 73 بارکد منحصربه‌فرد مرتبط بود که امکان تکثیر مولکولی مستقل و تخمین‌های قوی از فعالیت در بین بارکدها را فراهم می‌کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1 و جدول تکمیلی 1). علاوه بر این، ما 1500 کنترل مثبت و 3000 کنترل منفی را برای فعالیت و همچنین 1307 جفت توالی را به عنوان کنترل مثبت برای فعالیت دیفرانسیل در نظر گرفتیم. سپس کتابخانه را در سه تکرار به سلولهای غضروفی آلوده کردیم و بارکدهای RNA و DNA را برای تعیین کمیت بیان نسبی بارکد تعیین توالی کردیم.

در نهایت، سنجشی را برای کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز با تعیین توالی (ATAC-seq) و برش زیر اهداف و برچسب‌گذاری (CUT&Tag) برای استیلاسیون لیزین 27 روی هیستون H3 (H3K27ac) روی این سلول‌ها انجام دادیم تا cCREs در دسترس درون زا (Met) را شناسایی کنیم.

برای شناسایی توالی هایی که می توانند بیان را تحریک کنند، از MPRAnalyze 22 استفاده کردیم که به طور مشترک تعداد DNA و RNA را برای تخمین فعالیت رونویسی مدل می کند. اگر حداقل یکی از آلل‌های آن بیان معنی‌داری داشته باشد، یک جفت توالی به‌عنوان فعال طبقه‌بندی می‌شود (نرخ کشف نادرست (FDR) ≤ 0.05؛ روش‌ها). در مجموع، 65576 جفت توالی (90/17%) فعالیت قابل توجهی در حداقل یک آلل نشان دادند (داده های توسعه یافته شکل 2a-c و جدول تکمیلی 2).

ما تأیید کردیم که نتایج MPRA با دنبال کردن مراحلی که در دستورالعمل‌های کنترل کیفیت MPRA ما شرح داده شده است، فعالیت قانونی واقعی را نشان می‌دهد. ما معیارهای کلیدی زیر را آزمایش کردیم: (i) پیچیدگی DNA، (ii) پیچیدگی RNA، (iii) تکرارپذیری، (iv) محدوده دینامیکی فعالیت و (v) تطابق با سیگنال‌های درون‌زا، و دریافتیم که این آزمایش در تمام پنج معیار امتیازات بالایی را نشان داد (شکل 1b-e، داده‌های تکمیلی داده‌های تکمیلی، شکل‌های 2 و اطلاعات تکمیلی مشاهده شده در ادامه جزئیات، از جمله نقاط قوت و محدودیت های بیشتر MPRA ها).

برای شناسایی انواعی که فعالیت تنظیم‌کننده ژن انسان را تغییر می‌دهند، ما تغییر برابری بین آلل انسان (مشتق‌شده) و میمون بزرگ (اجداد) را با استفاده از MPRAanalyze 22 محاسبه کردیم. اگرچه فعالیت بین دو آلل بسیار همبسته بود (Pearson's r = 0.95، P <2.0 × 10-300؛ شکل 1f و داده های گسترده شکل 2b)، 15077 (23.0%) از cCRE های فعال فعالیت دیفرانسیل قابل توجهی را نشان دادند (FDR0 ≤، شکل 5.0. داده های توسعه یافته شکل های 2d-f و 4، جداول تکمیلی 4-7، اطلاعات تکمیلی و روش ها).

در اینجا نیز، خط لوله کنترل کیفیت 23 خود را برای ارزیابی استحکام فعالیت دیفرانسیل اعمال کردیم. به طور کلی، داده ها عملکرد قوی، از جمله تکرارپذیری بالا، محدوده دینامیکی گسترده و تطابق با سیگنال های تنظیمی درون زا را نشان دادند (شکل 1b-e و داده های توسعه یافته شکل 2).

بیان ژن نه تنها بوسیله جانشینی های تک نوکلئوتیدی، بلکه توسط کلاس های دیگر تغییرات سیس-تنظیمی، مانند ایندل ها و گونه های ساختاری، که در MPRA ما مورد سنجش قرار نگرفتند، شکل می گیرد. برای به دست آوردن واگرایی سیس-تنظیمی صرف نظر از کلاس نوع زیربنایی، ما از رده های سلولی ترکیبی آلوتراپلوئید استفاده کردیم که معمولا سلول های هیبریدی بین گونه ای نامیده می شوند. برخلاف ارگانیسم‌های هیبریدی که از طریق تولید مثل جنسی تولید می‌شوند، این سلول‌های هیبریدی با ترکیب تجربی سلول‌های کشت‌شده از دو گونه 24، 25، 26 تولید می‌شوند.

در چنین هیبریدهایی، آلل های دو گونه دارای هسته مشترک هستند، بنابراین محیط فراتنظیمی یکسانی را تجربه می کنند. در نتیجه، هر گونه تفاوت در بیان بین آلل های دو گونه باید به دلیل واگرایی سیس-اثر باشد 8 . علاوه بر این، هسته مشترک یک محیط به خوبی کنترل شده را فراهم می کند و عوامل غیر ژنتیکی مانند اثرات محیطی و دسته ای را به حداقل می رساند، که اغلب مقایسه های بین گونه ای را مخدوش می کند (شکل 2a).

نکته قابل توجه، برخلاف سلول‌های آنیوپلوئید، که در آن‌ها دوز نسبی ژن تحریف شده است، هیبریدهای کاملا تتراپلوئیدی گونه‌های نزدیک به هم یکپارچگی کاریوتیپی را حفظ می‌کنند، عمدتا دوز ژن متعادل سلول‌های دیپلوئید را حفظ می‌کنند و در شرایط آزمایشگاهی پایدار هستند. پلت فرم هیبریدی، به اطلاعات تکمیلی مراجعه کنید). این ویژگی‌ها، سلول‌های هیبرید را به ابزاری قدرتمند برای تشریح تکامل تنظیم‌کننده سیس تبدیل می‌کند.

الف، طرح ادغام سلول های انسان و گوریل. در سلول های هیبریدی، آلل ها یک محیط ترانس را به اشتراک می گذارند و بنابراین تغییرات بیانی نتیجه واگرایی سیس تنظیمی است. ب، تصاویر کنتراست فاز از اشتقاق استئوکندرال اندام از سلول‌های iPS هیبریدی انسان-گوریل و سلول‌های iPS انسانی کنترل مثبت. تمایز سه سلول هیبریدی انسان - شامپانزه و دو سلول انسان - گوریل به اجداد استخوانی در سه تکرار انجام شد. میله های مقیاس، 100 میکرومتر. ج، کاریوتیپ یک رده سلولی هیبریدی انسان-گوریل تتراپلوئید (HG2).

د، شماتیک پلاریزاسیون مبتنی بر صرفه جویی تغییرات بیان ژن سیس تنظیمی. ستاره ها نشان دهنده دودمانی است که احتمالا تغییر عبارت در آن ایجاد شده است.

برای بررسی تغییرات در بیان تنظیم‌کننده سیس در اسکلت انسان، ما یک پلت فرم آزمایشی متشکل از سلول‌های اسکلتی هیبریدی انسان-گوریل و انسان-شمپانزه ایجاد کردیم. برای دستیابی به این هدف، ابتدا سلول‌های بنیادی پرتوان القایی انسان و گوریل (iPS) را با استفاده از پروتکل هیبریداسیون 24، 25 برای تولید دو رده سلول‌های بنیادی پرتوان هیبرید انسان-گوریل (آلوتراپلوید) (شکل 2b و روش) ترکیب کردیم (شکل 2b و روش). ما هویت ترکیبی آنها را با استفاده از کاریوتایپ (شکل 2c) و PCR (داده های توسعه یافته شکل 6a) تأیید کردیم.

سپس، سلول‌های هیبریدی انسان-گوریل را به همراه سلول‌های هیبریدی انسان-شامپانزه که قبلا تولید شده بودیم، به سلول‌های پیش‌ساز استئوکندرال اندام متمایز کردیم (شکل 2b و داده‌های توسعه‌یافته شکل 6b،c و روش‌ها). این پلتفرم‌های هیبریدی انسان و میمون با هم به ما این امکان را می‌دهند تا تغییرات تنظیم‌کننده سیس خاص انسان را در بیان ژن اسکلتی شناسایی کنیم.

از آنجا که تفاوت در بیان ژن بین انسان و شامپانزه می‌تواند ناشی از تغییرات در هر دو اصل و نسب باشد، ما از سلول‌های پیش‌ساز هیبرید استخوانی انسان و شامپانزه برای شناسایی بیان متفاوت بین انسان و شامپانزه استفاده کردیم و سپس از سلول‌های پیش‌ساز هیبریدی استخوانی انسان و گوریل برای قطبی کردن دودمان استفاده کردیم (شکل 2). به طور کلی، ما 4152 تغییر خاص شامپانزه و 4463 تغییر خاص انسان را در بیان سیس تنظیمی شناسایی کردیم (جدول تکمیلی 8).

سلول‌های ترکیبی و MPRAها واگرایی تنظیمی را در دو سطح مکمل بررسی می‌کنند: سلول‌های ترکیبی تفاوت‌ها را در بیان تنظیم‌کننده سیس بین گونه‌ها نشان می‌دهند، در حالی که MPRA ها انواع نامزدی را که این تفاوت‌ها را هدایت می‌کنند شناسایی می‌کنند. برای ادغام این مجموعه داده‌ها در یک منبع ژن محور، هر cCRE را با پیروی از استراتژی پیاده‌سازی شده در GeneHancer 31 و چارچوب‌های MPRA 12 مخصوص انسان مدرن به ژن(های) هدف احتمالی آن مرتبط کردیم.

ما از ترکیبی از مجاورت ژنومی خطی و سه بعدی، ارتباطات آماری (بیان جایگاه صفات کمی؛ eQTLها)، همپوشانی با پروموترها و تغییرات مشترک بین بیان ژن و سطوح RNA تقویت‌کننده (eRNA) استفاده کردیم (جدول تکمیلی 9 و روش‌ها). از طریق این لایه‌های تنظیم‌کننده مکمل، ما ژن‌ها، مسیرها و عملکردهایی را که تنظیم آنها در طول تکامل اسکلتی انسان متفاوت بود، مورد مطالعه قرار دادیم.

برای بررسی عملکردهای بیولوژیکی متاثر از واگرایی نظارتی انسان، از چهار پلتفرم استفاده کردیم: (i) تجزیه و تحلیل مسیر نبوغ (IPA) 32. (ii) هستی شناسی ژن (GO) 33; (iii) پایگاه هستی شناسی فنوتیپ انسانی (HPO) 34; و (IV) پایگاه داده انجمن ژنتیک (GAD) 35. ابتدا، در هر پایگاه داده، ما برای غنی‌سازی ژن‌های مرتبط با cCRE‌های متفاوت فعال MPRA در مقایسه با ژن‌های مرتبط با سایر cCRE‌های فعال آزمایش کردیم (جدول تکمیلی 10). ما دریافتیم که مهم‌ترین غنی‌سازی در مسیر GAG مشاهده شد.

GAG ها زنجیره های کربوهیدراتی هستند که پروتئوگلیکان های ECM و مرتبط با سلول را تزئین می کنند. آنها در غضروف بسیار فراوان هستند و 15 تا 30 درصد وزن خشک آن را تشکیل می دهند و بعد از کلاژن در رده دوم قرار دارند. این مولکول‌ها به‌ویژه نقش مرکزی در مورفوژنز اسکلتی، سیگنال‌دهی فاکتور رشد و نگهداری غضروف دارند. در GO، ما غنی‌سازی فرآیند متابولیک GAG (2.2×، FDR = 0.03)، فرآیند متابولیک آمینوگلیکان (2.1×، FDR = 0.03) و مورفوژنز سیستم اسکلتی (1.8×، FDR = 0.04) را مشاهده کردیم (شکل 3a,b و جدول تکمیلی 11).

به طور مشابه، ما دریافتیم که در IPA 32، که فعال‌سازی و مهار را استنباط می‌کند، فرآیند کاهش قابل توجهی متابولیسم GAG بود (FDR = 4.0 × 10-6؛ جدول تکمیلی 11).

الف، شماتیک GAG ها در مقیاس های بیولوژیکی، از سطح بافت تا سطح مولکولی. At the molecular level, keratan sulfate and chondroitin sulfate chains are synthesized as repeating disaccharide polymers and are attached via a linker region to aggrecan. در سطح آگرکان، زنجیره‌های متعدد GAG پروتئین هسته آگرکان را تزئین می‌کنند و یک ماکرومولکول پر بار و هیدراته را تشکیل می‌دهند. در سطح ECM، مجموعه‌های آگرکان در ماتریکس غضروفی که سلول‌های غضروفی را احاطه کرده است، تعبیه می‌شوند.

در سطح بافت، این ساختارهای ECM در مجموع باعث ایجاد خواص مکانیکی و توسعه غضروف مفصلی می‌شوند. b، غنی‌سازی‌های عملکردی بالای cCRE‌های فعال متفاوت MPRA با استفاده از GO 33 (دایره‌ای G)، HPO 34 (دایره‌ای H) و GAD 35 (دایره‌ای D). اندازه دایره تعداد ژن ها را نشان می دهد. EBV، ویروس اپشتین بار. ج، بیان دیفرانسیل مشتق شده از انسان در ژن های مرتبط با GAG، مشاهده شده در سلول های پیش ساز استئوکندرال هیبریدی انسان-میمون. Only significantly differentially expressed genes are shown.

d، پیوند دهنده GAG و مسیر طویل شدن زنجیره (اقتباس از KEGG 38)، با تعداد و جهت cCREهای متفاوت MPRA فعال در هر ژن پوشیده شده است. گال، گالاکتوز؛ GalNAc، N-acetylgalactosamine. GlcA، اسید گلوکورونیک؛ GlcNAc، N-acetylglucosamine. SA، اسید سیالیک؛ زایلز، زایلوز. e، بسط مشتق شده از انسان تکرار لنگر GAG در ACAN. شکل ها نشان دهنده زیرگونه ها هستند (جدول تکمیلی 13). f، استنتاج بیشینه سازی انتظارات دو توزیع اعداد تکراری را مشخص می کند. این توزیع ها همچنین با ترکیب نوکلئوتیدی تکرارهایشان متمایز می شوند.

به عنوان مثال، افراد با تعداد تکرار کم تمایل دارند تکرارهای زیادی حاوی یک نوع CT>GA در موقعیت 30-31 تکرار داشته باشند.