حذف پری ناتال نورون های قشری انسان ناهنجار ژنتیکی

نورون های انسانی پس از میتوزی و عمر طولانی دارند و به تنظیم دقیق ژنومی نیاز دارند. عملکرد نرمال نورون بسیار حساس به دوز است، با انواع تعداد کپی (CNVs) و جهش‌های نقطه‌ای هتروزیگوت مرتبط با مجموعه‌ای از شرایط عصبی رشدی و عصبی روانی 1، 2، 3، 4. در اینجا ما CNV‌های سوماتیکی را که در سلول‌های عصبی منفرد ایجاد می‌شوند، بررسی کردیم تا فرآیندهای پویایی را که چشم‌انداز ژنتیکی نورون‌های طبیعی را شکل می‌دهند، درک کنیم. در مجموع، ما ۲۳۵۷ نورون منفرد را از مغز پس از مرگ انسان از دوران جنینی تا پس از تولد توالی یابی کردیم.

دو رویکرد توالی یابی کل ژنوم تک سلولی - تقویت مبتنی بر Tn5-transposase (1526 نورون، 16 نفر) و تقویت الگوی اولیه 5 (831 نورون، 12 نفر) - نشان داد که به طور متوسط 25.9٪ [12.7-46٪] از سلول های عصبی قبل از تولد، دارای یک قشر گسترده قبل از تولد هستند، CNV های شامل کروموزوم های متعدد. این نسبت پس از تولد در دو روش توالی یابی کل ژنوم تک سلولی حدود 4.5 برابر کاهش یافت (متاآنالیز فیشر P = 3.5 × 10-6).

نورون‌های دارای CNV گسترده عمدتا از طریق پری ناتال حذف شدند، تقریبا موازی با دوره‌های مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی ۶، در حالی که سلول‌های عصبی با بار CNV کوچک‌تر با سن پس از زایمان به کندی فرکانس کاهش یافتند. CNVها در نورون‌های زنده‌مانده برای ژن‌های حساس به دوز و ژن‌های دخیل در اختلالات رشد عصبی (آزمون Hypergeometric P <0.05) کاهش یافتند، که حاکی از حذف انتخابی نورون‌ها با این CNV‌ها است.

تجزیه و تحلیل 44861 هسته با سنجش تک هسته‌ای برای کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز (snATAC) و توالی‌یابی RNA تک هسته‌ای (snRNA-seq) نشان داد که نورون‌هایی با بار CNV بالا، غیرطبیعی بودن ژن سیناپسی را نشان می‌دهند، که نشان می‌دهد که تنظیم‌های عصبی غیرطبیعی به synapp تنظیم می‌شوند. حذف ژنوم‌های عصبی معیوب ممکن است نشان‌دهنده یک فرآیند کنترل کیفیت ژنوم رشدی باشد که ممکن است در بیماری‌های رشد عصبی آسیب‌پذیر باشد و انتخاب خالص را در طول توسعه عصبی انسان پیشنهاد می‌کند.

CNV در مقیاس کروموزومی در اوایل رشد پس از زیگوت رایج است، به طوری که تا 73٪ از جنین ها آنئوپلوئیدی کروموزومی بزرگ را در برخی از سلول ها نشان می دهند 7، 8، 9. به طور مشابه، سلول های پیش ساز عصبی انسان (NPCs) آنیوپلوئیدی موزاییکی گسترده ای را نشان می دهند که تا 30 درصد از اجداد را شامل می شود. نرخ آنوپلوئیدی در نورون‌های بالغ بحث‌برانگیز بوده است، با برخی گزارش‌ها از آنیوپلوئیدی گسترده 11، در حالی که گزارش‌های دیگر حاکی از آنیوپلوئیدی نادر 12، 13، 14، 15، 16 یا مکرر، عمدتا زیر کروموزومی CNVs 14، 11 است.

این اختلافات ناشی از تفاوت‌ها در روش‌شناسی و حساسیت تکنیک‌ها است، و مشخص نیست که آیا نرخ بالای آنوپلوئیدی مشاهده‌شده در اوایل رشد تا بزرگسالی در مغز حفظ می‌شود یا خیر.

کنترل تعداد کپی به ویژه در مغز بسیار مهم است، زیرا تنوع ژنتیکی در نورون‌ها می‌تواند تأثیر عملکردی عمیقی داشته باشد. اوتیسم، اسکیزوفرنی، صرع، ناتوانی ذهنی و سایر بیماری‌های عصبی-روان‌پزشکی معمولا توسط CNV‌های کروموزومی یا زیر کروموزومی و همچنین جهش‌های هتروزیگوت نقطه از دست دادن عملکرد در بیش از 1000 ژن که برای عملکردهای مغز ضروری هستند، ایجاد می‌شوند.

بسیاری از این ژن‌ها پروتئین‌های ساختاری سیناپس یا تنظیم‌کننده‌های پلاستیسیته سیناپسی را رمزگذاری می‌کنند، که نشان می‌دهد جنبه‌های کلیدی انعطاف‌پذیری عصبی که زمینه‌ساز این شرایط هستند، به شدت به دوز ژن حساس هستند.

اگرچه انواعی از نقاط بازرسی چرخه سلولی، پیش سازها را برای جلوگیری از ناهنجاری های ژنومی یا از بین بردن سلول های حاوی آنها تنظیم می کنند، مشخص نیست که آیا چنین مسیرهایی برای کنترل دوز ژن در سلول های غیر چرخه مانند نورون ها وجود دارد یا خیر. یک فرضیه نشان می‌دهد که نورون‌های ناهنجار ژنتیکی از طریق مرگ سلولی برنامه‌ریزی‌شده حذف می‌شوند، شکلی از آپوپتوز گسترده، که در قشر مغز انسان، تخمین زده می‌شود که بین ۲۰ تا ۵۰ درصد نورون‌ها در طول تکامل حذف شوند.

در تمام گونه‌های پستانداران مورد بررسی، واضح‌ترین موج آپوپتوز تا 30 درصد از نورون‌ها را در دوره پری ناتال از بین می‌برد 25 و به دنبال آن حذف مداوم نورون‌های پس از تولد 6، 26 همزمان با ایجاد مدارهای عصبی و اتصال به واسطه تشکیل سیناپس و هرس 27 است.

اگرچه نقش تشکیل سیناپس در تنظیم بقای عصبی برای بیش از یک قرن توصیف شده است، مکانیسم‌ها و اهمیت از دست دادن گسترده نورون‌ها مشخص نبوده است، زیرا نورون‌های در حال مرگ تمایل دارند در سراسر قشر پراکنده شوند، بدون ارتباط واضح با نوع سلول عصبی، مکان آرام یا الگوهای توپوگرافی، 32066.

با استفاده از توالی یابی کل ژنوم تک سلولی (scWGS)، ما CNV ها را در نورون های پست میتوتیک در طول رشد عصبی و پیری مقایسه کردیم. تجزیه و تحلیل ما نشان می‌دهد که CNV‌های گسترده در کروموزوم‌های نورون‌های جنینی وجود دارد و به دنبال آن اکثر نورون‌های دارای ژنوم بسیار معیوب در حوالی زمان تولد حذف می‌شوند. ما همچنین یافته‌های قبلی در مورد حذف کندتر سلول‌های معیوب را که پس از تولد در سن 17 سالگی اتفاق می‌افتد، تأیید کردیم. داده‌های ما همچنین نشان می‌دهد که این مکانیسم کنترل کیفیت ژنوم با مسیرهای ژنی که برای توسعه سیناپس ضروری هستند، از جمله ژن‌های مرتبط با بیماری، مرتبط است.

این یافته‌ها نشان می‌دهد که سیناپتوژنز می‌تواند نقش کلیدی در کنترل کیفیت ژنوم در نورون‌ها داشته باشد، و در نزدیکی تولد به شدت عمل می‌کند، اما در مراحل بعدی زندگی نیز گسترش می‌یابد. این فرآیند به طور بالقوه در برابر نقص های محیطی یا ژنتیکی آسیب پذیر است که رشد طبیعی مغز را مختل می کند.

برای نمایه‌سازی CNV در مغز قبل از تولد انسان، ابتدا داده‌های scWGS با پوشش کم را از 1526 نورون، جمع‌آوری‌شده از مغزهای غیر بیمار پس از مرگ از (1) نه اهداکننده دوران بارداری از هفته‌های 14 تا 25 بارداری و (2) هفت مغز پس از تولد از نوزادی یا بالاتر از 1pp تا 90 سال جمع‌آوری کردیم. برای به دست آوردن یک جمعیت خالص از نورون‌های قشر مغزی پیش از تولد پس از تولد، صفحه قشر قبل از تولد انسان (شکل 1b) را به دنبال فلوسیتومتری جدا کردیم تا تک هسته‌های عصبی را جدا کنیم (داده‌های توسعه یافته شکل 1a).

تشریح نورون‌های صفحه قشر مغز یک جمعیت نورونی جنینی منحصرا پس از میتوتیک و غیردوچرخه ایجاد می‌کند، زیرا NPCها و هسته‌های گلیال در نواحی عمیق‌تر قشری جدا نشده قرار دارند. نورون ها پس از خروج از چرخه سلولی و تبدیل شدن به پستمیتوتیک دائمی به صفحه قشر مغز مهاجرت می کنند. توالی یابی RNA تک هسته ای (snRNA-seq) تأیید کرد که تشریح صفحه قشر ما 98 درصد خلوص را برای نورون ها به همراه داشت (شکل 1b,c).

سوسپانسیون های هسته پس از تولد با آنتی بادی ضد NeuN (نشانگر عصبی) و 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) قبل از فلوسیتومتری برای جداسازی هسته های عصبی همانطور که قبلا توضیح داده شد رنگ آمیزی شدند (داده های توسعه یافته شکل 1a). کتابخانه‌های scWGS با استفاده از تقویت مبتنی بر Tn5 (TbA) پس از حذف پروتئین‌های مرتبط با کروماتین با پروتئیناز K تولید و در عمق 0.05× توالی‌یابی شدند (روش‌ها و داده‌های توسعه‌یافته شکل 1b).

تقویت ژنوم کامل تک سلولی مبتنی بر Tn5 (scWGA) 32، 33 برای scWGS منجر به پوشش یکنواخت ژنوم می شود، یعنی امتیازات اختلاف زوجی مطلق میانه پایین (MAPD) ​​و مقرون به صرفه بودن برای مقیاس بندی. در مورد ما، این روش scWGA برای فعال کردن یک خط لوله اعتبار سنجی بیوانفورماتیک برای غلبه بر چالش‌های معمول در اعتبارسنجی CNV انتخاب شد، زیرا بستر DNA تک سلولی اصلی در فرآیند scWGA از بین می‌رود.

برای ایجاد مرجعی برای پروفایل‌های ژنومی با کیفیت بالا، NPC‌های کشت‌شده را با و بدون یکپارچگی هسته‌ای مختل شده پس از القای مرگ سلولی با استاوروسپورین مشخص کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1c) و این داده‌ها را به‌عنوان پایه‌ای برای یادگیری انتقال به کار بردیم تا پروفایل‌های توالی‌یابی با کیفیت بالا از کیفیت پایین را از بافت‌های پس از مرگ داده‌های پس از مرگ تشخیص دهیم. این مراحل کنترل کیفیت دقیق، همراه با محدود کردن MAPD به کمتر از 0.5 (داده های توسعه یافته شکل 1j)، منجر به 1248 ژنوم عصبی تک سلولی با کیفیت بالا شد.

a، مروری بر طراحی مطالعه برای scWGS، کپی شماره تماس و تجزیه و تحلیل پایین دست. b , Cortical plate dissection of frozen normal prenatal human brain isolates neuronal nuclei, confirmed by snRNA-seq. بنفش تیره و روشن به ترتیب نشان دهنده هسته های عصبی تحریک کننده و مهار کننده هستند. زرد نشان دهنده هسته های غیر عصبی است. ج، جداسازی هسته با تشریح صفحه قشر مغز و تایید انواع سلول از تشریح صفحه قشر قبل از تولد توسط snRNA-seq.

ExN، نورون تحریکی. InhN، نورون مهاری. IP، اجداد متوسط؛ RG، گلیا رادیال؛ Pg، پیش ساز عصبی. OPC، سلول پیش ساز الیگودندروسیت؛ میکروفن، میکروگلیا؛ انتهای، سلول اندوتلیال. d، شماتیک اعتبارسنجی FOD در کتابخانه‌های TbA که در آن برچسب‌گذاری Tn5 تک ژنوم‌ها الگوهای متمایز همپوشانی مولکولی را ایجاد می‌کند که حالت‌های شماره کپی را متمایز می‌کند. e, f, Circos نمودار پروفایل های CNV و توزیع سود-از دست دادن در بین 470 نورون قشر مغز با کیفیت بالا قبل از تولد (e) و 478 پس از تولد (f) که توسط TbA تقویت شده اند.

کروموزوم ها به صورت محیطی مرتب شده اند و نورون ها بر اساس اندازه کل CNV به صورت متحدالمرکز مرتب می شوند. CNV اهداکنندگان با کمتر از 25 نورون با کیفیت بالا را تجزیه و تحلیل می‌کند.

برای شناسایی CNV ها، از HiScanner 34 استفاده کردیم، الگوریتمی که قبلا به طور خاص برای تشخیص CNV در داده های scWGS توسعه داده بودیم. برای استحکام در برابر نویز تقویت و پوشش توالی پراکنده، HiScanner الگوهای حذف آللی خاص فناوری را از داده‌های scWGS مدل‌سازی می‌کند و از تقسیم‌بندی احتمالی برای حفظ دقت تشخیص بالا استفاده می‌کند. علاوه بر این، ما یک رویکرد اعتبار سنجی انفورماتیک دیگر طراحی کردیم: متریک همپوشانی قطعه (FOD).

کتابخانه‌های مبتنی بر Tn5-transposase منجر به یک ویژگی کتابخانه‌ای خاص می‌شوند به این صورت که انتظار داریم همه قطعات تقویت‌شده موقعیت‌های شروع و پایان منحصربه‌فرد مولکول برچسب‌گذاری شده اصلی را حفظ کنند. بنابراین، در یک منطقه کپی از دست دادن، که در آن فقط یک آلل وجود دارد، هیچ قطعه ای نباید بر خلاف مناطق کپی خنثی یا افزایش کپی (شکل 1d) همپوشانی داشته باشد. این اکتشافی با متریک FOD (روش‌ها) نشان داده می‌شود، که ما از آن برای افزایش بیشتر دقت تشخیص CNV خود استفاده می‌کنیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2a-g و نتایج تکمیلی).

ما دریافتیم که نورون‌هایی با ژنوم‌های ناهنجار در قشر مغز انسان قبل از تولد و پس از تولد وجود دارند (شکل 1e,f و جدول تکمیلی 2). بسیاری از ژنوم‌های دارای تغییرات دارای چندین ناحیه آسیب‌دیده در بیش از یک کروموزوم بودند که اغلب شامل تغییرات زیادی در تعداد نسخه‌ها می‌شد. در نمونه های قبل از تولد، تلفات کپی اسما بیشتر از سود کپی بود، به طوری که 53٪ (3,090/5,844) از CNV ها از دست دادن کپی و 47٪ (2,754/5,844) سود کپی بودند. در نورون های پس از تولد، از دست دادن کپی (59٪، 1،722/2،921) دوباره بیشتر از افزایش کپی بود (41٪، 1،199/2،921).

ما مشاهده کردیم که نورون‌های دوران بارداری حداقل یک CNV با هر اندازه‌ای را بیشتر از نورون‌های پس از تولد حمل می‌کنند (میانگین 62.9% در مقایسه با 29.2%؛ P = 0.002)، که این تفاوت ناشی از هر دو افزایش کپی (میانگین 40.6% در مقایسه با 10.0%؛ P = 0.0002؛ P = 0.32% با 4% تلفات) است. 0.04) (آزمون t دو طرفه Student در سراسر؛ داده های گسترده شکل 2h).

از آنجایی که آستانه‌های مبتنی بر اندازه یا شمارش CNV دلخواه نمی‌توانند پیچیدگی بیولوژیکی واقعی هر نورون را که می‌تواند حامل CNV‌های کوچک و در مقیاس کروموزومی باشد، به تصویر بکشد، ما آنالیز امضای جهشی 35، 36 را برای طبقه‌بندی سلول‌هایی با ژنوم‌های نابجا اعمال کردیم. با استفاده از کاتالوگ امضای شماره کپی کیهانی (کاتالوگ جهش‌های جسمی در سرطان) 36، ما نورون‌ها را به چهار گروه مشخصه متمایز طبقه‌بندی کردیم (جدول تکمیلی 3): (1) نورون‌های CNV غالب با دیپلوئید (COSMIC SigCN1)، که نشان‌دهنده نورون‌هایی با حداقل ژن‌ها و آنهایی با دیپلوئید CNV است.

2a)؛ (2) CNVs غالب (ترکیبی از SigCN1 و SigCN2). (3) CNVs غالب با تلفات کانونی (SigCN1 و SigCN9). و (4) CNVs غالب با ضرر (SigCN1 و SigCN13). سه گروه آخر نورون هایی با CNV گسترده را نشان می دهند (شکل 2a و داده های گسترده شکل 3). در مقایسه با نورون‌های CNV غالب دیپلوئید، نورون‌های CNV گسترده دارای تغییرات ژنومی هستند که نواحی بزرگ‌تری از ژنوم، توزیع‌های اندازه بزرگ‌تر CNV را در بر می‌گیرند و آنئوپلوئیدی بیشتری دارند (در اینجا به عنوان افزایش یا از دست دادن بیش از 90 درصد کروموزوم تعریف می‌شود) (شکل 4 توسعه یافته).

این امضاهای شماره کپی عصبی بسیار شبیه به مواردی است که در COSMIC از سرطان ها تعریف شده است (میانگین شباهت کسینوس 0.9716؛ داده های گسترده شکل 3d)، که نشان می دهد CNV های عصبی ممکن است در سلول های در حال تقسیم، احتمالا NPC ها، در مغز انسان در حال رشد به وجود آمده باشند.

a، امضاهای عددی را کپی کنید که توسط چهار خوشه امضای اولیه که در همه نورون‌های انسانی شناسایی شده‌اند، نمایش داده می‌شوند. پانل سمت چپ نمایه‌های شماره کپی تک نورونی را برای هر یک از گروه‌های امضا نشان می‌دهد، پانل میانی مشخصه طیف شماره کپی ترکیبی هر گروه را نشان می‌دهد، و نمودارهای نواری در پانل سمت راست، تجزیه نوردهی امضا را نشان می‌دهد. ب، نسبت نورون ها با CNV های گسترده مشاهده شده در نورون های قبل از تولد و پس از تولد انسان با استفاده از دو فناوری متمایز scWGA تعیین شد.

نمودارهای جعبه ای نشان دهنده میانه، چارک های اول و سوم (لولا) و شدیدترین نقاط داده است که از 1.5× محدوده بین چارکی (IQR) دورتر از لولا (سبیل) نیستند. آزمون t دو طرفه Student; n = 9 قبل از تولد، 7 اهداکننده پس از تولد (948 نورون QC نهایی را گذراندند؛ TbA). n = 5 اهداکننده قبل از تولد، 7 اهداکننده پس از تولد (659 نورون QC نهایی را گذراندند؛ PTA). هر نقطه نشان دهنده نسبت نورون ها با CNV های گسترده در یک اهدا کننده با استفاده از TbA یا PTA است.

ج، فراوانی نورون‌های با CNVهای گسترده به سرعت بین اواسط بارداری و دوره پس از زایمان کاهش می‌یابد و در طول زندگی پس از زایمان کم می‌ماند. هر نقطه نشان دهنده نورون های تجزیه و تحلیل شده برای یک اهداکننده است. Results from two distinct scWGA technologies are shown. د، ارتباط بین نقاط شکست CNV و دهک‌های زمان‌بندی تکثیر، برای همه نقاط شکست (سیاه)، نمونه‌های پس از تولد (آبی) و نمونه‌های قبل از تولد (نارنجی) نشان داده شده است.

هر نقطه نسبت مشاهده شده/مورد انتظار (O/E) چگالی نقطه شکست CNV در دهک زمان‌بندی تکرار است (دهک 1 = زودترین، دهک 10 = آخرین تکرار). خطوط جامد برازش رگرسیون خطی هستند و نوارهای سایه دار فاصله اطمینان 95 درصدی آن تناسب هستند. ضرایب همبستگی (r) و مقادیر P توسط همبستگی پیرسون دو طرفه بین نسبت O/E و دهک زمان تکرار (n = 10 دهک؛ درجه آزادی = 8) به دست آمد. مقادیر دقیق P در پانل نشان داده شده است.

e , 3D reconstruction of DAPI staining from confocal microscopy of the fetal cortical plate showing primary nuclei and micronuclei (arrowheads). f , Schematic of serial sucrose gradient fractionation to obtain micronuclear and primary nuclear fractions for sequencing. g، مقدار مطلق کسر ریزهسته‌ای محتوای ژنومی نسبت به فراکسیون‌های هسته‌ای جفت شده با افزایش سن کاهش می‌یابد. n = 8 اهدا کننده. هر نقطه میانگین ± 95% فاصله اطمینان را در بین n = 22 اتوزوم در آن اهدا کننده نشان می دهد. داده ها برای محتوای GC کروموزومی با رگرسیون خطی تنظیم شدند.

نسبت نورون‌های دارای CNV گسترده (سه گروه آخر از چهار گروه تعریف شده در بالا) در نمونه‌های دوران بارداری به طور متوسط ​​25.9٪ (محدوده 12.7-46.0٪) بود، اما پس از تولد 4.2 برابر به حدود 6.2٪ کاهش یافت (P = 0.002؛ دو طرفه Student's t -test (شکل t -2b). میانگین در دوران نوزادی (0-2 سال) 7.1٪ و برای نمونه های مسن تر (بیش از 60 سال) 4.8٪ بود (شکل 2b،c)، که نشان دهنده ثبات نسبی این جمعیت در طول پیری پس از زایمان است.

برای تأیید نتایج خود از TbA، ما تقویت الگوی اولیه (PTA) 5 را در سلول‌های عصبی منفرد، به‌عنوان یک روش متعامد scWGA، روی 831 هسته عصبی اضافی از 5 اهداکننده قبل از تولد و 7 اهداکننده پس از تولد، انجام دادیم که 659 نورون با کیفیت بالا را به‌دست آوردند که فیلترهای QC سخت‌گیرانه و Fig.2 Tab. سلول های عصبی تکثیر شده با PTA در عمق بالاتر (حدود 0.5×) توالی یابی شدند، که منجر به تقویت ژنوم به طور کلی همانطور که توسط MAPD تعیین شد (داده های توسعه یافته شکل 5a,b).

امضاهای شماره کپی مشتق شده از نورون های تقویت شده با PTA نیز به گروه های متمایز کاملا مطابق با دسته بندی های CNV غالب و گسترده از TbA جدا می شوند (داده های توسعه یافته شکل 5c-f). میانگین نسبت نورون CNV گسترده بین دوره های قبل از تولد و پس از تولد 4.6 برابر کاهش یافت، به ترتیب از 33.1٪ به 7.2٪ از نورون ها (0.0001 = P، آزمون t Student، دو طرفه؛ شکل 2b، c)، و برای هر رده سنی، نسبت TV از NB به طور قابل توجهی متفاوت بود.

مقدار P متاآنالیز ترکیبی فیشر در هر دو روش scWGA برای تغییرات قبل از تولد-پس از تولد P = 3.5 × 10-6 بود. برای اطمینان از اینکه کاهش مشاهده شده در نسبت نورون‌های دارای ژنوم ناهنجار تحت تأثیر سلول‌های با کیفیت ضعیف قرار نمی‌گیرد، بررسی کردیم که هیچ ارتباط قابل‌توجهی از نسبت گسترده CNV با درصد نورون‌هایی که از فیلترهای کنترل کیفیت (QC) عبور می‌کنند و اندازه نمونه وجود ندارد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 6a,b). نمونه های قبل از تولد به عنوان یک گروه دارای فاصله پس از مرگ (PMI) کمتری بودند (داده های توسعه یافته شکل.

6c)، اما مصنوع مبتنی بر PMI می‌تواند نسبت CNV گسترده‌تر را در PMI طولانی‌تر پیش‌بینی کند، و چنین ارتباط مثبتی مشاهده نشد (r2 = 0.05، P = 0.44).

گزارش های قبلی نشان می دهد که نسبت نورون هایی که حداقل یک CNV را در خود جای داده اند با سن 14 و 17 سالگی کاهش می یابد. در داده‌های ترکیبی TbA و PTA ما، این نسبت از 63.9٪ قبل از تولد به 30.9٪ در دوره‌های اولیه پس از زایمان (سن 5-0 سال) کاهش یافت (0007/0 = P). از اوایل پس از تولد تا سنین بعدی (6 سال به بالا)، ما یک روند اسمی به سمت کاهش میانگین نسبت از 30.9٪ به 22.5٪ پیدا کردیم (P = 0.27، هر دو آزمون t دو طرفه Student با تصحیح بونفرونی؛ داده های توسعه یافته شکل 7a).

بنابراین، کاهش اولیه مجددا در دوران بارداری اتفاق می‌افتد، با تغییر بعدی که به تنهایی در داده‌های ما اهمیت پیدا نمی‌کند. بنابراین، ما یک متاآنالیز را با ترکیب داده‌های TbA و PTA در مطالعه خود و شش مطالعه scWGA اضافی در نورون‌های پس از تولد (جدول تکمیلی 4) با استفاده از یک مدل رگرسیون مختلط خطی انجام دادیم، بنابراین تفاوت‌های پلتفرم توالی‌یابی و روش‌های فراخوانی CNV از مطالعات مستقل را از نظر آماری محاسبه کردیم.

در بدو تولد، این مدل تخمین زد که تقریبا 32.8٪ از سلول ها دارای CNV هستند (95٪ فاصله اطمینان (CI) 25.8-39.9٪)، و سن به طور قابل توجهی با نسبت نورون های حامل هر CNV مرتبط بود (0.27- درصد در سال، P = 0.0001؛ Extended e-Nb Data Limiting، پشتیبانی از شکل 7-Nb). نورون ها در طول زندگی پس از زایمان

برای تعیین اینکه آیا CNV ها در تکثیر سلول های پیش ساز یا نورون های پست میتوتیک به وجود می آیند، ما ارتباط آنها را با زمان تکثیر DNA و شکست های فیزیولوژیکی دو رشته ای (DSBs) تجزیه و تحلیل کردیم. ما دریافتیم که چگالی نقطه شکست CNV با زمان‌بندی تکثیر همبستگی زیادی دارد (Pearson r = 0.95، P <0.0001)، به طوری که نقاط شکست CNV در نواحی دارای تکثیر اولیه بیشتر بود (شکل 2d و داده‌های توسعه یافته شکل 8a). این نتیجه نشان می دهد که CNV ها ممکن است در سلول های پیش ساز میتوزی در طول همانندسازی DNA تولید شوند.

ما بعدا نقاط داغ DSBها را در NPCها که قبلا توسط برچسب‌گذاری در محل تعلیق و تعیین توالی (BLISS) تعیین شده بود، ارزیابی کردیم، زیرا DSBها با تولید CNV در بیماری‌های عصبی مرتبط هستند. نقاط داغ BLISS (1٪ بالای مناطق BLISS) با از دست دادن کپی در نقاط شکست مکرر CNV بین اهداکنندگان همراه بود و یک روند اسمی به سمت غنی‌سازی در نقاط BLISS مرتبط با افزایش کپی در نقاط شکست مکرر CNV نشان داد (0.06 = P؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل 8b).

در مقابل، نقاط شکست CNV منحصر به فرد نورون ها (به دست آوردن یا از دست دادن) به طور قابل توجهی با نقاط حساس BLISS مرتبط نبود (داده های توسعه یافته شکل 8c). تجزیه و تحلیل نقاط شکست مکرر درون اهداکننده به اندازه کافی نیرو داده نشد. با هم، این یافته‌ها نشان می‌دهند که جایگاه‌های مستعد DSB در نقاط شکست مکرر CNV، با قوی‌ترین شواهد برای تلفات کپی، نقش دارند.