ریپلیزوم های انسانی یک پریماز رشته اصلی اختصاصی را برای راه اندازی مجدد چنگال هدایت می کنند

اختلالات در سنتز رشته‌ای منجر به اختلال می‌شود و چنگال‌های تکثیر را متوقف می‌کند، زیرا سنتز DNA توسط پلیمراز رشته‌ای پیشرو، Pol ε، برای باز کردن بهینه قالب توسط هلیکاز تکراری CMG (CDC45-MCM-GINS) ضروری است. شکست در راه اندازی مجدد کارآمد و/یا محافظت از چنگال های تکثیر متوقف شده منبع اصلی بی ثباتی ژنومی است 3، 4، 5، 6. چنگال‌های متوقف شده را می‌توان با مکانیسم‌های مختلفی راه‌اندازی کرد، از جمله بازگرداندن مجدد در پایین دست مانع 4.

در سلول های انسانی، پریماز-پلیمراز PRIMPOL پیشرفت چنگال را در طول تنش همانندسازی 7، 8، 9، 10 افزایش می دهد، اما چگونگی هماهنگی فعالیت آن توسط replisome حل نشده است. در اینجا، با بازسازی و راه‌اندازی مجدد چنگال تکثیر با پروتئین‌های انسانی خالص شده، نشان می‌دهیم که هلیکاز CMG PRIMPOL را برای راه‌اندازی کارآمد چنگال تکثیر هدایت می‌کند. به طور غیرمنتظره، تعامل بین PRIMPOL و پروتئین تکرار A 9، 11 برای راه اندازی مجدد فورک در این سیستم حیاتی نیست.

ما نشان می‌دهیم که PRIMPOL مستقیما به CMG متصل می‌شود و یک ساختار میکروسکوپ الکترونی کرایو نشان می‌دهد که چگونه PRIMPOL را به طور خاص برای پرایمینگ رشته‌ای پیشرو هدف قرار می‌دهد تا اندازه شکاف‌های پس از تکرار را به حداقل برساند. حذف کنش متقابل CMG-PRIMPOL، راه اندازی مجدد فورک را در شرایط آزمایشگاهی و تحمل آسیب DNA وابسته به PRIMPOL را در سلول های انسانی لغو می کند. کار ما PRIMPOL را به عنوان یک مؤلفه یکپارچه از replisome انسانی که به پرایمینگ رشته اصلی اختصاص داده شده است، ایجاد می کند.

بای پس ضایعه DNA توسط بازپرداخت رشته پیشرو برای رپلیزوم هسته اشریشیا کلی نشان داده شد، که در آن سنتز پرایمر توسط پریماز انجام می شود که همچنین مسئول تکثیر رشته عقب مانده است 12، 13. در مقابل، رپلیزوم‌های یوکاریوتی بازسازی‌شده از پروتئین‌های ساکارومایسس سرویزیه خالص‌شده نمی‌توانند به طور موثر سنتز را در پایین دست ضایعات رشته‌ای پیشرو از سر بگیرند، زیرا کمپلکس Pol α-primase که مسئول پرایمینگ هر قطعه اوکازاکی است به سمت الگوی رشته‌ای عقب‌افتاده هدف قرار می‌گیرد.

این مکانیسم هدف‌گیری در رپلیزوم انسانی 14 حفظ شده است، که نشان می‌دهد پرایمینگ ناکارآمد روی رشته پیشرو توسط Pol α-primase یک ویژگی جهانی رپلیزوم‌های یوکاریوتی است.

برخلاف S. cerevisiae، انسان یک پریماز اضافی به نام PRIMPOL 7، 8، 9 دارد. PRIMPOL یک آنزیم مونومر با 560 اسید آمینه (aa) است که شامل یک مارپیچ آمینو پایانی 21 aa با عملکرد ناشناخته، یک دامنه آرکیو-یوکاریوتی پریماز (AEP)، یک DNA تک رشته ای (ssDNA) متصل به انگشت روی (ZnF) و دو تکثیر پروتئینی (ZnFinRPA) است. (RBMs) 6، 15.

شواهد گسترده از رده‌های سلولی انسان، موش و مرغ نشان می‌دهد که PRIMPOL در شرایطی که DNA پلیمرازهای همانندسازی شونده 8، 9، 10 را متوقف می‌کند، پیشرفت چنگال تکثیر را ارتقا می‌دهد و این به فعالیت پریماز 10، 16، 17، 18 PRIMPOL منجر می‌شود که منجر به تشکیل ga19-5 دختر می‌شود. مدل‌های کنونی نشان می‌دهند که PRIMPOL از طریق تعامل مستقیم با RPA 9، 11، 16 برای چنگال‌های تکثیر استخدام می‌شود.

با این حال، از آنجا که RPA اساسا با الگوی رشته‌ای عقب‌افتاده مرتبط است، مشخص نیست که آیا این حالت استخدام برای پرایمینگ کارآمد PRIMPOL در رشته پیشرو کافی است یا اینکه آیا یک مکانیسم اضافی PRIMPOL را به طور خاص به الگوی رشته پیشرو هدایت می‌کند تا چنگال‌های تکراری متوقف شده را نجات دهد.

برای بررسی مجدد رشته اصلی توسط PRIMPOL در زمینه replisome، ما از سیستمی استفاده کردیم که اخیرا برای جمع‌آوری رپلیزوم‌های انسانی سریع و کارآمد از پروتئین‌های خالص شده توسعه داده‌ایم. در این روش، CMG ابتدا بر روی انتهای دوشاخه‌ای یک الگوی DNA 9.7 کیلوبایتی بارگذاری می‌شود، قبل از اینکه پروتئین‌های اضافی برای جمع‌آوری رپلیزوم‌هایی که تکثیر DNA با رشته پیشرو و عقب‌افتاده قوی انجام می‌دهند، اضافه شوند (شکل 1a). Pol ε بخش عمده ای از سنتز رشته پیشرو را انجام می دهد، در حالی که Pol α-primase و Pol δ رشته عقب مانده را تکرار می کنند.

RFC و CTF18-RFC فاکتور فرآیندی پلیمراز PCNA را به ترتیب روی رشته‌های عقب مانده و پیشرو بار می‌کنند، و TIMELESS (TIM)–TIPIN، CLASPIN و AND1 با CMG مرتبط می‌شوند تا پیشرفت سریع رپلیزوم را ارتقا دهند. برای نظارت بر توقف و راه اندازی مجدد چنگال، یک دایمر پیریمیدین سیکلوبوتان منفرد (CPD) - یک ضایعه مهم DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش (UV) و یک بلوک قوی برای پلیمرازهای تکثیر شونده - به الگوی رشته پیشرو 3.5 کیلوبایت از انتهای دوشاخه شده 1، 20 معرفی شد.

الف، شماتیک سنجش تکثیر DNA چنگالی با یک الگوی حاوی ضایعه CPD با رشته پیشرو. ب، دوره زمانی یک سنجش تکرار بر روی الگوی CPD رشته پیشرو در غیاب یا حضور PRIMPOL. ج، تجزیه و تحلیل ژل دو بعدی یک واکنش تکرار 30 دقیقه در حضور PRIMPOL.

شکل 1b نشان می‌دهد که CPD یک بلوک قوی برای سنتز DNA رشته‌ای است (محصول سرب 3.5 کیلوبایتی در ژل دناتوره‌کننده)، که باعث توقف چنگال‌های تکثیر می‌شود، همانطور که توسط گونه‌های آهسته مهاجرت در ژل بومی (چنگال متوقف شده) مشاهده می‌شود. هنگامی که CPD جایگزین محل آباسیک تتراهیدروفوران شد، رفتار مشابهی مشاهده شد (داده های توسعه یافته شکل 1a).

افزودن PRIMPOL باعث کاهش جمعیت چنگال متوقف شده و تجمع محصولات تمام قد در ژل بومی شد، همزمان با ظاهر یک محصول تقریبا 6.2 کیلوبایتی در ژل دناتوره کننده (شکل 1b، خطوط 5-8، راه اندازی مجدد محصول سرب). این نتیجه به شدت نشان داد که PRIMPOL راه اندازی مجدد چنگال را با بازپرداخت رشته پیشرو ترویج می کرد. برای تأیید اینکه محصولات 6.2 کیلوبایتی ناشی از بازپرداخت رشته پیشرو هستند، محصولات با الکتروفورز ژل دو بعدی تجزیه و تحلیل شدند (شکل 1c).

این نشان داد که محصولات 6.2 کیلوبایتی به طور انحصاری با محصول تمام قد در ژل بومی مرتبط بودند و تقریبا دو برابر شدیدتر از محصول 3.5 کیلوبایتی استال پیشرو بودند، همانطور که برای محصولات راه اندازی مجدد با حسن نیت انتظار می رفت. علاوه بر این، تکثیر الگوی CPD در حضور یک جهش یافته PRIMPOL معیوب به پریماز (ZnFD 2A) 10 تنها رشته های پیشرو متوقف شده و قطعات اوکازاکی را ایجاد کرد (داده های توسعه یافته شکل 1b). این داده‌ها بازسازی موفقیت‌آمیز راه‌اندازی مجدد چنگال تکثیر را با استفاده از پروتئین‌های انسانی خالص‌شده نشان می‌دهند.

راه اندازی مجدد چنگال همانندسازی نیز به طور موثر پس از توقف پلیمراز در یک محل آباسیک رخ داد (داده های توسعه یافته شکل 1c)، که نشان می دهد مکانیسم بازپرداخت نسبت به ماهیت شیمیایی ضایعه مسدود کننده اولیه آگنوستیک است. راه‌اندازی مجدد نیز مستقل از Pol δ (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1d) و Pol α-primase (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1c) رخ داد، که نشان می‌دهد فقط Pol ε برای گسترش پرایمر ساخته شده توسط PRIMPOL در این سیستم مورد نیاز است. بنابراین، مگر اینکه گفته شود، Pol δ از آزمایش‌های بعدی حذف می‌شود تا از عوارض سنتز جابجایی رشته جلوگیری شود.

برخلاف Pol α-primase که ترجیح زیادی برای rNTP ها برای سنتز پرایمر دارد 21، به دنبال rNTP 5، PRIMPOL dNTP ها را با کارایی بسیار بالاتر از rNTP ها به دلیل مکانیسم تشخیص قند ترکیب می کند. مطابق با این ویژگی‌ها، حذف GTP، CTP و UTP راه‌اندازی مجدد رشته اصلی را به خطر نینداخت (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1e، خطوط 7 و 8 را مقایسه کنید)، که نشان می‌دهد ATP برای شروع پرایمر در این سنجش‌ها کافی است.

با این حال، علی‌رغم گزارش‌های قبلی مبنی بر اینکه منگنز فعالیت پرایمینگ PRIMPOL را در شرایط آزمایشگاهی 8 تحریک می‌کند، افزودن آن باعث افزایش کارایی راه‌اندازی مجدد نشد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1f).

مشاهده که محصولات راه اندازی مجدد نزدیک به حداکثر طول ممکن (6.2 کیلوبایت) بودند، نشان داد که آنها در فاصله بسیار کوتاهی از ضایعه شروع شده اند. برای به دست آوردن یک نمای با وضوح بالا از راه اندازی مجدد رشته پیشرو، ما یک استراتژی برای نقشه برداری مکان های پرایمینگ با وضوح نزدیک به تک نوکلئوتید ابداع کردیم (شکل 2a). برای انجام این کار، محصولات پس از تکرار با آنزیم های محدود کننده هضم شدند که در بالادست و پایین دست ضایعه را برش می دادند تا قطعاتی را آزاد کنند که می توانند در ژل های توالی یابی پلی آکریل آمید حل شوند.

شکل 2b نشان می دهد که به غیر از رشته پیشرو متوقف شده و جمعیت کوچکی از محصولات خواندنی، نردبانی از محصولات با هضم واکنش حاوی PRIMPOL (خط 4) ایجاد شد. نتیجه می گیریم که هر باند در نردبان مربوط به یک سایت بازپرداخت رشته پیشرو منحصر به فرد است. قابل توجه است که اکثر آغازگرهای وابسته به PRIMPOL که برای شروع مجدد تکثیر استفاده می‌شوند، در 50 نوکلئوتید CPD سنتز شدند، حتی زمانی که غلظت PRIMPOL به 5 نانومولار کاهش یافت (داده‌های توسعه یافته شکل 2a).

یک الگوی نردبان غیرقابل تشخیص به دنبال تکرار الگوی سایت آباسیک مشاهده شد (داده های توسعه یافته شکل 2b)، که نشان می دهد ماهیت شیمیایی ضایعه DNA هیچ نقشی در مشخصات سایت اولیه ندارد. از آنجایی که CMG احتمالا پس از توقف پلیمراز 1، 2 به کندی باز کردن DNA را ادامه می‌دهد، این داده‌ها نشان می‌دهند که فعالیت PRIMPOL بلافاصله پس از توقف پلیمراز به سمت الگوی رشته پیشرو هدف قرار می‌گیرد، که اندازه شکاف دختر-رشته را به کمتر از 50 نوکلئوتید در این الگو محدود می‌کند.

الف، شماتیک محصولات پیش بینی شده تولید شده از هضم محصولات همانندسازی با SalI و NruI. ب، ژل پلی آکریل آمید اوره با یک واکنش تکرار 40 دقیقه ای که در یک . ج، شماتیک الگوی DNA که در آن یک توالی 162-nt بعد از CPD با یک توالی جایگزین جایگزین شد. d، ژل پلی آکریل آمید اوره یک واکنش تکرار 40 دقیقه ای حاوی PRIMPOL، پردازش شده مانند یک . Pol δ از آزمایشات در b و d حذف شد. بدون آسیب.

کار قبلی نشان داد که PRIMPOL ترجیحات توالی را برای شروع سنتز پرایمر نشان می دهد 23، 24، 25. بنابراین ما استدلال کردیم که الگوی متمایز محصولات راه اندازی مجدد در آزمایشات ما نتیجه توالی DNA پایین دست CPD است. برای آزمایش این، یک ناحیه 162 nt در پایین دست CPD را اصلاح کردیم (شکل 2c). تکرار این الگوی اصلاح شده در حضور PRIMPOL یک الگوی متمایز از محصولات راه‌اندازی مجدد را با محصولاتی از الگوی اصلی CPD ایجاد کرد (شکل 2d، خطوط 3 و 4 را مقایسه کنید).

این نشان می دهد که بازپرداخت رشته پیشرو توسط PRIMPOL در زمینه رپلیزوم انسانی توسط توالی DNA تعدیل می شود. نکته مهم، علیرغم توالی تغییر یافته، اکثر محصولات راه اندازی مجدد مجددا در کمتر از 50 نوکلئوتید CPD شروع شدند، با یک محصول برجسته که حدود 100 nt از CPD شروع شد (شکل 2d، خط 4). این با هر دو الگوی حاوی چندین تطابق نزدیک با توالی شروع آغازگر سه نوکلئوتیدی ترجیحی برای PRIMPOL 25 مطابقت دارد.

این کشف که بازپرداخت با واسطه PRIMPOL در فاصله کوتاهی از CPD در دو الگوی مجزا رخ داده است، نشان می‌دهد که یک مکانیسم کارآمد PRIMPOL را به سمت الگوی رشته‌ای پیشرو هدایت می‌کند. ما فرض کردیم که این توسط RBMها در پایانه PRIMPOL C 11 انجام شده است، و PRIMPOL را به RPA متصل به الگوی رشته پیشرو پس از توقف پلیمراز در CPD و ادامه باز شدن قالب توسط CMG، استخدام می‌کند.

برای بررسی این موضوع، ما دو جهش PRIMPOL را تولید کردیم که در اتصال RPA معیوب بودند: یکی فاقد هر دو RBM بود و دیگری حامل یک جهش در RBM-A (RBM-A RA) بود که مکان یابی PRIMPOL را به کروماتین در سلول های انسانی 11 لغو کرد (شکل 3a). شکل 3b نشان می دهد که هر دو جهش یافته PRIMPOL راه اندازی مجدد رشته پیشرو را با کارایی قابل مقایسه با نوع وحشی PRIMPOL ترویج کردند. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل محصولات راه‌اندازی مجدد نشان داد که هر دو جهش‌یافته همان الگوی محل بازپرداخت را مانند PRIMPOL نوع وحشی نشان دادند (شکل 3c).

ما نتیجه می‌گیریم که تعاملات با واسطه RBM بین PRIMPOL و RPA برای راه‌اندازی مجدد چنگال تکرار با رپلیزوم‌های انسانی بازسازی‌شده غیر ضروری هستند.

الف، نمودارهای ساختار اولیه که جهش‌ها و برش‌های نقطه‌ای PRIMPOL و PRIMPOL را نشان می‌دهد. b، تجزیه و تحلیل ژل آگارز دناتوره کننده یک واکنش تکرار 40 دقیقه ای با جهش یافته های PRIMPOL نشان داده شده است. ج، تجزیه و تحلیل ژل پلی آکریل آمید اوره از یک واکنش تکرار 40 دقیقه ای بر روی الگوی CPD با جهش های اتصال RPA نشان داده شده PRIMPOL انجام شد. محصولات پس از تکرار با SalI و NruI هضم شدند. d، تجزیه و تحلیل ژل آگارز دناتوره کننده یک واکنش تکرار 40 دقیقه ای با حذف اجزای غیر ضروری رپلیزوم روی قالب های سالم و CPD در حضور PRIMPOL.

e، آنالیز SDS-PAGE رنگ آمیزی شده با نقره از یک آزمایش pull-down با پروتئین های مشخص شده. WT، نوع وحشی.

غیر ضروری بودن RBMهای PRIMPOL برای راه‌اندازی مجدد چنگال، همراه با نزدیکی مجدد مجدد به ضایعه، ما را بر آن داشت تا این ایده را بررسی کنیم که PRIMPOL ممکن است از طریق تعامل با replisome هسته به چنگال‌های متوقف شده هدایت شود. حذف تمام اجزای غیر ضروری replisome هسته به صورت جداگانه راه اندازی مجدد رشته اصلی را لغو نکرد (شکل 3d). بنابراین ما فرض کردیم که PRIMPOL ممکن است مستقیما توسط هلیکاز CMG استخدام شود. مطابق با این ایده، آزمایش pull-down در شکل 3e نشان می دهد که PRIMPOL به طور خاص با CMG تعامل دارد.

برای بررسی نحوه جذب PRIMPOL به CMG، و اینکه چگونه این امر ممکن است بازپرداخت کارآمد رشته پیشرو را تسهیل کند، ما ساختاری از PRIMPOL متصل به CMG را توسط میکروسکوپ کریو الکترونی تک ذره ای (cryo-EM) تعیین کردیم (توسعه داده ها شکل 3a-d و جدول داده های توسعه یافته 1). چگالی Cryo-EM به خوبی حل شده برای دامنه PRIMPOL AEP در کنار حوزه های ATPase MCM4 و MCM7 که بخشی از لایه C ترمینال (C-tier) حلقه هگزامریک دو لایه MCM را تشکیل می دهند، بازیابی شد (شکل 4a,b).

این آرایش توسط یک مارپیچ α 21-aa حفظ شده در انتهای N PRIMPOL که به MCM7 متصل می شود و یک حلقه تقریبا 20 aa بلافاصله در پایین دست مارپیچ که بین یک شیار کم عمق روی MCM4 و دامنه AEP PRIMPOL قرار گرفته است (شکل 4b,c ended,c and ext.) قرار می گیرد. دامنه AEP PRIMPOL به صورت جانبی در مجاورت خروجی منفذ مرکزی MCM قرار گرفته است، که از طریق آن الگوی رشته پیشروی بازشده بیرون می‌آید.

علاوه بر این، قرار دادن ساختار کریستالی PRIMPOL متصل به DNA پرایمر-الگو 26 بر روی دامنه AEP در ساختار ما نشان می‌دهد که هسته کاتالیزوری آن برای پشتیبانی مستقیم از سنتز پرایمر جهت‌گیری شده است، زیرا DNA الگو از CMG تغذیه می‌شود (شکل 4d و داده‌های توسعه‌یافته شکل 4c).

a، نقشه چگالی Cryo-EM ساختار CMG-PRIMPOL که بر اساس اشغال زیر واحد رنگ شده است. b، نمای نزدیک PRIMPOL به MCM4 و MCM7 متصل شده است. مدل اتمی در نمایش روبان نشان داده شده است. چگالی cryo-EM به عنوان یک سطح نیمه شفاف نشان داده شده است. ج، نمودار ساختار اولیه PRIMPOL با نواحی قابل مشاهده در ساختار cryo-EM به رنگ صورتی نشان داده شده است. d، مدلی که مسیر احتمالی DNA از CMG به PRIMPOL را نشان می دهد. ساختار پروتئین نشان داده شده ساختار CMG-PRIMPOL از این مطالعه است.

DNA در مدل با برهم نهی ساختار PRIMPOL-DNA (بانک داده پروتئین (PDB): 5L2X) و ساختار DNA با چنگال CMG (PDB: 7PFO) بر روی ساختار PRIMPOL-CMG در این مطالعه تولید شد.

با هدایت ساختار cryo-EM خود، برای ارزیابی نقش تعامل CMG-PRIMPOL در راه اندازی مجدد چنگال تکرار، 39 aa اول PRIMPOL (PRIMPOL ∆1-39) را حذف کردیم (شکل 5a و داده های توسعه یافته شکل 5a). شکل 5b نشان می دهد که PRIMPOL نوع وحشی اما نه PRIMPOL ∆1-39 به شدت توسط CMG به پایین کشیده شد، و تأیید می کند که پایانه PRIMPOL N دارای نقش های اولیه تعامل CMG است. PRIMPOL ∆1-39 فعالیت پریماز را روی یک الگوی ssDNA حفظ کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5b) اما نتوانست راه‌اندازی مجدد چنگال را با بازپرداخت رشته‌ای در رپلیزوم انسانی (شکل 5c,d, lane 4) ترویج کند.

این نقص با افزودن Pol δ برطرف نشد (داده های توسعه یافته شکل 5c). نتیجه می‌گیریم که تعامل بین PRIMPOL و CMG برای بازپرداخت مجدد رشته‌های پیشرو توسط رپلیزوم‌های انسانی بازسازی‌شده ضروری است.

a، نمودارهای ساختار اولیه PRIMPOL با تمرکز بر مناطقی در انتهای N که به MCM7 و MCM4 متصل می شوند. جهش تولید شده در آن منطقه نشان داده شده است. b، آنالیز SDS-PAGE با رنگ‌آمیزی نقره و وسترن بلات آزمایشی با پروتئین‌های نشان‌داده‌شده. c، d، آگاروز دناتوره کننده (c) و اوره پلی آکریل آمید (d) تجزیه و تحلیل ژل واکنش های تکرار 40 دقیقه ای با جهش یافته های PRIMPOL. نمونه ها در d پس از تکرار با SalI و NruI هضم شدند. e , نمای نزدیک از تعامل بین PRIMPOL و MCM4.

مدل در نمایش روبان در چگالی نیمه شفاف cryo-EM نشان داده شده است. بقایای اسید آمینه که برای جهش زایی هدف قرار گرفته اند (چوب) به تصویر کشیده می شوند. f، تجزیه و تحلیل ژل آگارز دناتوره‌کننده یک واکنش تکرار 40 دقیقه‌ای بر روی الگوی CPD با غلظت‌های مشخص‌شده PRIMPOL. g، سنجش حساسیت سیس پلاتین برای رده های سلولی TK6 مشخص شده انجام شد. داده ها میانگین سه تکرار بیولوژیکی هستند و نوارهای خطا نشان دهنده انحراف استاندارد هستند.

مقادیر P نتیجه آزمایش های آماری با استفاده از تجزیه و تحلیل دو طرفه داده های بقای سلولی با برازش یک مدل درجه دوم خطی با حداکثر احتمال است (برای همه مقادیر P به جدول داده های توسعه یافته 2 مراجعه کنید). pcna K164R در مقایسه با +PRIMPOL ∆1–39 P ** = 0.0064554، primpol/pcna K164R در مقایسه با + PRIMPOL P * = 0.024598.

ما بعدا بررسی کردیم که آیا تعامل بین PRIMPOL و CMG به طور انحصاری در استخدام PRIMPOL عمل می‌کند یا اینکه آیا موقعیت‌یابی دقیق دامنه AEP برای راه‌اندازی مجدد چنگال تکراری کارآمد ضروری است. لغو برهمکنش PRIMPOL با MCM7 با حذف مارپیچ α در انتهای N انتهایی PRIMPOL (شکل 5a، PRIMPOL ∆1-21) منجر به کاهش متوسطی در راه اندازی مجدد رشته پیشرو شد (شکل 5c، دناتوره شدن، خط 5)، با رویدادهای نامتناسب با بسته شدن CPD (تأثیر نامتناسب با CPD) ، صفحه اوره، خط 5).

حفظ α-مارپیچ 1-21 اما جایگزینی حلقه بعدی (aa 22-39) با یک پیوند دهنده گلیسین-سرین (شکل 5a، PRIMPOL GS22-39)، یا جایگزینی شش باقیمانده در حلقه به آلانین (شکل 5a، PRIMPOL، 6A، محصولات باقی مانده از بین رفته است) ، خطوط 6 و 7). این نتایج اهمیت این حلقه را که بین MCM4 و دامنه PRIMPOL AEP قرار دارد برای راه‌اندازی مجدد رشته اصلی برجسته می‌کند.

علاوه بر این، هدف قرار دادن سه باقیمانده حلقه که در رابط با MCM4 قرار دارند (Arg31، Leu32 و Ser33؛ شکل 5a، حلقه PRIMPOL 3A) منجر به نقص کمتر شدیدتری نسبت به جهش‌یافته‌ای که زنجیره‌های جانبی Tyr28 و Arg29 را هدف قرار می‌دهد تا پیوند بین PMCRIMOLEP و دامنه پل‌سازی را مختل کند، منجر شد. 5a، حلقه PRIMPOL 2A) (شکل 5c–e). این مشاهدات قویا نشان می‌دهد که قرارگیری PRIMPOL سفت و سخت در کنار ردیف C MCM برای راه‌اندازی مجدد کارآمد رشته پیشرو در replisome انسانی ضروری است.

در سیستم بازسازی شده ما، تعامل بین PRIMPOL و CMG (شکل 5c)، اما نه بین RBM های PRIMPOL و RPA (شکل 3b)، برای راه اندازی مجدد چنگال ضروری است. بنابراین، از آنجا که PRIMPOL RBM-A برای فعالیت PRIMPOL در سلول‌های 9، 11، 16، 17 مورد نیاز است، ما فرض کردیم که تعامل با واسطه RBM ممکن است برای افزایش غلظت محلی PRIMPOL در چنگال تکثیر مفید باشد. این تابع ممکن است در شرایط استاندارد واکنش in vitro ما که از غلظت نسبتا بالایی (20 نانومولار) PRIMPOL استفاده می‌کند، مورد نیاز نباشد.

برای آزمایش این ایده، ما یک تیتراسیون از نوع وحشی PRIMPOL و PRIMPOL ΔRBM انجام دادیم. با PRIMPOL نوع وحشی، راه اندازی مجدد رشته پیشرو تنها زمانی کارآمدتر شد که غلظت پروتئین به 0.1 نانومتر کاهش یافت (شکل 5f و داده های توسعه یافته شکل 5d). در مقابل، راه اندازی مجدد رشته پیشرو در 1 نانومتر PRIMPOL ΔRBM به خطر افتاد و در 0.1 نانومتر به سختی قابل تشخیص بود. این یافته‌ها با مدلی سازگار است که در آن تعامل با واسطه RBM بین PRIMPOL و RPA محلی‌سازی PRIMPOL را در چنگال تکرار تسهیل می‌کند.