سلول های بنیادی آلوئولی برای تحریک بازسازی برونش ها متمایز می شوند

ریه از دو بخش مجزا از نظر تشریحی تشکیل شده است: راه های هوایی و آلوئول. اگرچه سلول‌های بنیادی اپیتلیال راه هوایی برای بازسازی آلوئولی بسیج می‌شوند، اما اینکه آیا سلول‌های آلوئولی می‌توانند متقابلا این مرزهای آناتومیکی را طی کنند و به ترمیم برونش کمک کنند، مشخص نیست 1، 2، 3، 4. در اینجا ما تکنیک‌های ردیابی اصل و نسب با واسطه دوگانه رکومبیناز را در موش توسعه دادیم تا نشان دهیم سلول‌های آلوئولی نوع 2 (AT2) به برونشیول‌های آسیب‌دیده مهاجرت می‌کنند و به سلول‌های باشگاهی و سلول‌های مژکدار متمایز می‌شوند و در نتیجه به طور فعال به بازسازی راه هوایی کمک می‌کنند.

از نظر مکانیکی، پس از آسیب برونش، سلول‌های ایمنی نفوذی SPP1 ترشح می‌کنند و یک گرادیان کموتاکتیکی را ایجاد می‌کنند که مهاجرت سلولی را هدایت می‌کند. سلول های AT2 پری برونشیولار این سیگنال SPP1 را از طریق اینتگرین ITGB1 حس می کنند و به سمت برونشیول های آسیب دیده مهاجرت می کنند. در بدو ورود، این سلول‌های AT2 مهاجرت‌شده لیگاندهای Notch را از سلول‌های مژه‌دار ساکن دریافت می‌کنند که منجر به فعال‌سازی مسیر Notch می‌شود که به نوبه خود باعث تمایز آنها به سلول‌های کلاب می‌شود. این فرآیند تمایز با یک مرحله میانی همراه است که با بیان Cldn4 مشخص شده است.

محاصره عملکردی SPP1 یا ITGB1 مهاجرت سلولی AT2 را مختل می کند، در حالی که مهار سیگنال دهی Notch مانع از تمایز آنها به سلول های کلاب می شود. در مجموع، یافته‌های ما یک مکانیسم سلولی متقاطع را برای ترمیم اپیتلیال برونش نشان می‌دهد، درک فعلی را از پلاستیسیته بازسازی‌کننده ریه گسترش می‌دهد و به طور بالقوه استراتژی‌های درمانی را برای آسیب راه هوایی اطلاع‌رسانی می‌کند.

بیماری های مزمن و حاد ریوی (مانند بیماری انسدادی مزمن ریه، آسم، ذات الریه و برونشکتازی) شامل آسیب اپیتلیال برونش است که بازسازی راه هوایی را مختل می کند و پیشرفت را بدتر می کند 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11. بنابراین درک مکانیسم های سلولی و مولکولی ترمیم اپیتلیال برای درمان های هدفمند حیاتی است. اپیتلیوم ریه شامل بخش های مجزایی است - نای، برونشیول ها و آلوئول ها - که هر کدام دارای پیش سازهای تخصصی هستند که هموستاز و ترمیم را حفظ می کنند 5، 12، 13، 14.

در نای، سلول های پایه به عنوان سلول های بنیادی چند توان 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21 عمل می کنند که پوشش اپیتلیال را حفظ می کنند. برونشیل ها حاوی سلول های کلاب و سلول های عصبی غدد درون ریز (NE) هستند که باعث بازسازی موضعی می شوند 22، 23، 24، 25. محفظه آلوئولی متکی به سلول های آلوئولی نوع II (AT2) است که خود تجدید می شوند و به سلول های AT1 تمایز می یابند تا تبادل گاز را حفظ کنند 26، 27، 28، 29، 30، 31.

سلول های بنیادی برونکوآلوئولار (BASCs)، که در محل اتصال مجرای برونش آلوئولی (BADJ) قرار دارند و Scgb1a1 و Sftpc را بیان می کنند، در هر دو بخش برونشیولار و آلوئولی چند توانی را نشان می دهند 32، 33، 34، 35. مطالعات اخیر همچنین پلاستیسیته سلول های باشگاهی را در ترمیم آلوئول 1، 2، 3، 4 نشان می دهد.

در حالی که پیش سازهای راه هوایی به ترمیم آلوئول کمک می کنند، ظرفیت متقابل سلول های آلوئولی برای مشارکت در بازسازی برونش هنوز مشخص نیست. مطالعات آزمایشگاهی نشان می‌دهد که سلول‌های AT2 انسانی می‌توانند به سلول‌های بازال راه هوایی 36 و به سلول‌های ترشحی برونشیتی تمایز پیدا کنند، پدیده‌ای که در مدل‌های آسیب پستانداران غیر انسانی نیز مشاهده می‌شود. با این حال، محدودیت‌های دستکاری ژنتیکی در این سیستم‌ها، از شواهد قطعی in vivo برای این تعمیر بین‌بخشی جلوگیری کرده است.

در مدل‌های موش، ردیابی اصل و نسب Sftpc-creER معمولی فاقد ویژگی لازم برای ردیابی دقیق سرنوشت سلول AT2 پس از آسیب نایژه است، زیرا هر دو AT2 و BASC Sftpc 32 را بیان می‌کنند که منجر به برچسب‌گذاری همزمان می‌شود. با توجه به اینکه BASC ها به طور فعال به ترمیم برونش کمک می کنند، این برچسب گذاری مشترک، تفسیر مشارکت های اختصاصی سلول های AT2 را مخدوش می کند. بنابراین، ابزارهای ژنتیکی جدیدی برای ردیابی انتخابی AT2 مورد نیاز است تا مشخص شود که آیا سلول‌های آلوئولی به بازسازی برونش در داخل بدن کمک می‌کنند یا خیر.

در این مطالعه، ما یک سیستم برچسب‌گذاری در داخل بدن مخصوص AT2 را با استفاده از یک استراتژی ردیابی نسب با واسطه نشانگر دوگانه ایجاد کردیم. با استفاده از این رویکرد در مدل‌های آسیب نایژه، متوجه شدیم که سلول‌های AT2 می‌توانند در سراسر مرزهای آناتومیکی مهاجرت کرده و به سلول‌های عملکردی کلاب و مژک دار درون برونشیول‌ها متمایز شوند و به ترمیم اپیتلیال متقاطع کمک کنند. از نظر مکانیکی، این فرآیند به مهاجرت با واسطه اینتگرین-β1 و مشخصات سرنوشت وابسته به Notch بستگی دارد.

پس از آسیب نایژه، سلول‌های ایمنی نفوذی SPP1 ترشح می‌کنند تا مهاجرت سلولی AT2 را به سمت برونشیول‌های آسیب‌دیده هدایت کنند، جایی که سلول‌های مژکدار باقیمانده سیگنال‌دهی Notch را فعال می‌کنند تا تمایز AT2 به کلوب را هدایت کند.

ما ابتدا منشا بازسازی برونش را پس از آسیب نفتالین شناسایی کردیم. ما سلول های SFTPC + AT2 را در داخل اپیتلیوم برونش پس از آسیب مشاهده کردیم که نشان دهنده دخالت بالقوه آنها در ترمیم است (داده های توسعه یافته شکل 1a,b). برای ردیابی سلول‌های AT2، Sftpc-creER (مرجع 38) را با موش‌های R26-tdTomato (R26-tdT) تلاقی کردیم. در 4 هفته پس از آسیب، سلول‌های نشاندار شده با SFTPC به داخل برونشیول‌ها مهاجرت کردند و به سلول‌های باشگاهی و AT1 متمایز شدند (داده‌های توسعه یافته شکل 1c-e). با این حال، سلول های SFTPC + شامل دو نوع سلول مجزا هستند: سلول های SFTPC + AT2 و SFTPC + SCGB1A1 + BASC (شکل داده های توسعه یافته، شکل 2).

1f,g). این تمایز بسیار مهم است زیرا BASCها، که مقاوم به نفتالین هستند، می توانند پس از آسیب به سلول های باشگاهی متمایز شوند 33، 34، 35 (داده های توسعه یافته شکل 1h-j). بنابراین، سیستم‌های تک رکامبیناز مانند Sftpc-creER نمی‌توانند این جمعیت‌ها را متمایز کنند، که به طور بالقوه تفسیر اختصاصی AT2 را مخدوش می‌کند.

برای تعیین سهم اختصاصی سلول AT2، ابتدا با قرار دادن گیرنده سم دیفتری (DTR) و توالی GFP در جایگاه Scgb1a1، یک خط ضربه‌ای Scgb1a1-DTR-GFP ایجاد کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 1k). در این سیستم، تمام سلول‌های بیان‌کننده Scgb1a1 (سلول‌های کلاب و BASCs) باید GFP و DTR را با هم بیان کنند و باعث فرسایش با واسطه توکسین دیفتری (DT) شود. رنگ‌آمیزی ایمنی بیان GFP/DTR را در تمام جمعیت‌های SCGB1A1+ در موش‌های تحت درمان با وسیله نقلیه تأیید کرد، در حالی که درمان DT به طور مؤثر سلول‌های GFP+ را حذف کرد و عملکرد سیستم را تأیید کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1-p).

ما در مرحله بعدی موش های تراریخته سه گانه تولید کردیم: Sftpc-creER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP (شکل 1a,b). همانطور که پیش‌بینی شد، تیمار تاموکسیفن سلول‌های AT2 (فقط tdT +)، BASCs (tdT + GFP +) و سلول‌های باشگاهی (فقط GFP +) را نشان‌دار کرد. ما از این سیستم به عنوان AT2-tracer1 یاد می کنیم. این موش ها با تاموکسیفن و DT تحت درمان قرار گرفتند و بافت ریه برای تجزیه و تحلیل جمع آوری شد (شکل 1c).

a,b, شماتیک استراتژی ژنتیکی برای ردیابی اختصاصی سلول های SFTPC + SCGB1A1 – AT2 (AT2-tracer1) (a) و فرسایش سلول های SCGB1A1 + (سلول های کلوپ و BASCs) (b). سلول‌های کلوپ، BASC و سلول‌های AT2 به ترتیب با GFP +، GFP + tdT + و tdT + نشان‌دار شدند. ج , شماتیک طرح آزمایشی. د، روز؛ w، هفته ها d – f، ایمونوهیستوشیمی برای tdT و GFP در مقاطع ریه 2 روز پس از تاموکسیفن (d)، 2 روز پس از DT (e) و 4 هفته پس از درمان DT (f). تعیین کمیت تعداد سلول های GFP + در هر فیلد 10×. n = 5 موش. داده ها میانگین ± s.d هستند.

نوک پیکان های زرد رنگ tdT + GFP + BASC ها را در d و سلول های tdT + GFP + کلوب را در f نشان می دهند. g، رنگ آمیزی ایمنی برای tdT، GFP، ECAD، SCGB1A1، AGER، SFTPC و FOXJ1 بر روی مقاطع ریه در 4 هفته پس از DT. نوک پیکان‌های سفید سلول‌های tdT + ECAD +، tdT + GFP + SCGB1A1 + سلول‌های باشگاهی، tdT + AGER + سلول‌های AT1، سلول‌های tdT + SFTPC + AT2 یا tdT + FOXJ1 + سلول‌های مژه‌دار را نشان می‌دهند. h، کمی سازی درصد سلول های GFP + کلاب (کلاب) نشاندار شده توسط tdT در برونشیول ها در گرم. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 5 موش.

i، تعیین کمیت درصد AT2-tracer1 در برونشیول های بیان کننده GFP، SFTPC، AGER و FOXJ1. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 5 موش. j، ایمونوهیستوشیمی برای tdT، GFP و PDGFRα در مقاطع ریه در 3 روز پس از DT. نوک پیکان های سفید نشان دهنده مهاجرت سلول های tdT + است. pDT، تجویز سم پس از دیفتری. k، تعیین کمیت رویدادهای مهاجرت دودمان AT2 (مسیر 1 و مسیر 2) به عنوان درصد در روزهای مختلف پس از DT. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 5 موش.

l، شماتیک دو مسیر ورود AT2 به برونشیول ها: مسیر 1، از طریق BADJ (فلش های آبی). مسیر 2، از طریق کانال های ترانس برونش (فلش های قرمز). br، برونشیل؛ regen., regenerated; تام، تاموکسیفن. برای d – g و j، میله‌های مقیاس، 100 میکرومتر (نوارهای سفید) و 50 میکرومتر (نوارهای زرد). هر تصویر رنگ آمیزی ایمنی نماینده 5 موش است.

تجویز DT به طور انتخابی جمعیت های GFP + را حذف کرد و تنها سلول های tdT + AT2 را در آلوئول ها باقی گذاشت (شکل 1d,e). پس از 4 هفته بهبودی، ردیابی نسب نشان داد که سلول های AT2 نشاندار شده با tdT به برونشیول ها مهاجرت کردند و سلول های کلاب tdT + GFP + را تولید کردند (شکل 1f). این سلول‌های مشتق شده از AT2 منحصرا به سلول‌های اپیتلیال مثبت E-cadherin (ECAD) از جمله سلول‌های کلاب، سلول‌های AT1، سلول‌های مژکدار و سلول‌های AT2 تمایز نیافته تمایز یافتند (شکل 1g). کمی‌سازی نشان داد که 71/4 ± 42/77 درصد از سلول‌های کلاب جدید از سلول‌های AT2 منشا گرفته‌اند (شکل 1h).

سلول های مشتق شده از AT2 در برونشیول ها شامل 4.55 ± 38.18 درصد سلول های کلاب، 14.61 ± 2.62 درصد سلول های تمایز نیافته AT2، 18.90 ± 4.48 درصد سلول های AT1 و 0.27 ± 0.07 درصد سلول های مژه دار هستند (شکل. سلول‌های کلاب tdT + GFP + مشتق از AT2 اغلب در نزدیکی سلول‌های مژه‌دار باقی‌مانده موضعی می‌شوند، در حالی که نواحی عاری از مژه‌دار توسط سلول‌های غیرکلابی، از جمله سلول‌های AT1 مانند tdT + مسطح پوشیده شده‌اند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1q-t). ما همچنین سلول های شبه GFP + SFTPC + BASC مشتق از AT2 نادر را در روزهای 7، 14 و 28 پس از DT شناسایی کردیم (به ترتیب 0.15 ± 0.87، 0.16 ± 0.70 درصد و 0.08 ± 0.33 درصد؛ داده های توسعه یافته، شکل 1u).

این داده‌ها شواهد قاطعی را ارائه می‌دهند که سلول‌های AT2 به طور فعال مهاجرت می‌کنند و در ترمیم اپیتلیال برونشیول شرکت می‌کنند.

ما بیشتر دو مسیر مهاجرتی را برای سلول های مشتق شده از tdT + AT2 به سمت برونشیول های آسیب دیده شناسایی کردیم: از طریق BADJ (مسیر 1) و از طریق کانال های دیواره برونش (مسیر 2) (شکل 1j و داده های توسعه یافته شکل 2a-g). رنگ‌آمیزی ایمنی نشان داد که این کانال‌ها شکاف‌هایی در دیواره برونشیول هستند که توسط سلول‌های AT1 مشتق از tdT + AT2 پوشانده شده‌اند و لومن راه هوایی را به فضاهای آلوئولی متصل می‌کنند. پوشش tdT + اپیتلیوم برونش با گذشت زمان افزایش یافت (داده های توسعه یافته شکل 2e)، و هر دو مسیر در طول زمان قابل مشاهده باقی ماندند (داده های توسعه یافته شکل 2f,g).

تجزیه و تحلیل کمی نشان داد که رویدادهای مسیر 1 به سرعت از روز 3 تا 7 افزایش یافت، در حالی که رویدادهای مسیر 2، اگرچه در روز 3 قابل تشخیص بودند، تنها افزایش متوسطی را تا روز 7 نشان دادند (شکل 1k). این داده‌ها نشان می‌دهند که سلول‌های AT2 عمدتا از طریق مسیر 1 کمک می‌کنند، با مسیر 2 به عنوان یک مسیر تکمیلی (شکل 1l).

برای بررسی اینکه آیا سلول‌های AT2 در سطح تک سلولی مشارکت دارند، ما موش‌های Sftpc-creER;R26-Confetti;Scgb1a1-DTR-GFP را تولید کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 2i-k). نتایج ما نشان داد که سلول‌های AT2 برچسب‌گذاری‌شده به‌صورت جداگانه دارای ظرفیت تمایز چندگانه در طول ترمیم برونش، از جمله سلول‌های کلاب و AT1 هستند (داده‌های توسعه یافته شکل 2k,l). تجزیه و تحلیل کمی نشان داد که جمعیت برونشیول مشتق از AT2 شامل 90/7 ± 69/33 درصد کلوپ، 42/3 ± 17/17 درصد AT2 تمایز نیافته و 78/4 ± 24/24 درصد سلول AT1 است (داده های توسعه یافته شکل 2 متر).

بنابراین، سلول‌های AT2 منفرد می‌توانند در طول ترمیم نایژه ناشی از DT به دودمان‌های متعدد متمایز شوند (داده‌های گسترده شکل 2n).

سلول‌های بازال که به عنوان سلول‌های بنیادی اپیتلیال راه هوایی عمل می‌کنند، عمدتا در نای و با حداقل حضور در برونشیول‌های انتهایی قرار دارند و نقش مهمی در بازسازی اپیتلیال دارند. برای ردیابی سرنوشت سلول های پایه، ما از موش های p63-dreER;R26-RSR-tdT (R26-rox-stop-rox-tdTomato) استفاده کردیم، که در آنها سلول های پایه پروگزیمال به طور موثر با tdT برچسب گذاری شدند. سلول‌های پایه tdT + نادر نیز در برونشیول‌های دیستال شناسایی شدند (داده‌های توسعه یافته شکل 3a-c).

ما سپس از موش‌های p63-dreER;R26-RSR-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP برای ردیابی همزمان سلول‌های پایه (tdT +) و سلول‌های کلاب (GFP + ؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل 3d) استفاده کردیم. پس از القای تاموکسیفن و درمان DT، ما ریه ها را پس از یک دوره 4 هفته ای ترمیم آنالیز کردیم (داده های توسعه یافته شکل 3e). رنگ آمیزی ایمنی نشان داد که تقریبا تمام سلول‌های GFP + کلاب بازسازی‌شده در نای tdT+ بودند که منشأ سلول‌های بازال آنها را تأیید می‌کند. علاوه بر این، سلول‌های بازال نادر در برونشیول‌های دیستال تحت انبساط کلونال قرار گرفتند و تعداد کمی از سلول‌های باشگاهی را تشکیل دادند.

این یافته‌ها نشان می‌دهد که سلول‌های بازال در درجه اول مجاری هوایی پروگزیمال را بازسازی می‌کنند. علاوه بر این، ما سلول‌های سروزی داخل لوبولار (IS) SCGB3A2 + SCGB1A1 - را در برونشیول‌ها شناسایی کردیم که مطابق با گزارش‌های قبلی 39 بود (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3h,i). تعداد این سلول‌ها نادر بودند اما پس از آسیب DT تکثیر شدند، که نشان می‌دهد ممکن است در بازسازی سلول‌های باشگاهی نیز شرکت کنند (داده‌های توسعه یافته شکل 3j-m).

از آنجایی که سلول‌های NE در بازسازی سلول‌های باشگاه نقش دارند، ما سهم آنها را پس از آسیب DT با استفاده از موش‌های Ascl1-creER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP آزمایش کردیم، که به طور خاص سلول‌های CGRP + NE (tdT + ) را در حالی که سلول‌های کلاب را حذف می‌کردند (شکل 3-3) بررسی کردیم. در 4 هفته پس از آسیب، رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی و کمی سازی، جمعیت کوچکی از سلول های کلاب tdT + GFP + را شناسایی کردند که 36/1 ± 59/4 درصد از سلول های کلوپ دیستال را تشکیل می دادند (داده های توسعه یافته شکل 3q-s). بنابراین، سلول‌های NE زیرمجموعه کوچکی از سلول‌های باشگاهی را پس از آسیب ایجاد می‌کنند (داده‌های توسعه یافته شکل 3t).

همراه با یافته‌های قبلی، این نتایج نشان می‌دهد که بازسازی سلول‌های باشگاهی مختص محفظه است، که عمدتا توسط سلول‌های AT2 و سلول پایه، با کمک‌های جزئی از سلول‌های NE یا سلول‌های احتمالی IS هدایت می‌شود.

برای مطالعه فیزیولوژیکی بازسازی با واسطه AT2، به جای فرسایش DT از نفتالین استفاده کردیم. از آنجایی که سلول‌های مقاوم به نفتالین (مانند BASCs) پس از آسیب باقی می‌مانند 22، 33، 40، ردیابی AT2 تک رکامبیناز معمولی به دلیل برچسب‌گذاری مخدوش‌کننده بالقوه قابل استفاده نیست. برای غلبه بر این، ما از یک سیستم recombinase دوگانه با گزارشگر تودرتو (R26-NR) 41 استفاده کردیم، که در آن نوترکیب Dre-Rox و Cre-loxP ZsGreen (ZsG) و tdT را به ترتیب 41 فعال می کنند (شکل 2a). ما موش‌های Scgb1a1-creER;Sftpc-dreER;R26-NR را برای ردیابی سلول‌های AT2 مستقل از BASCها تولید کردیم.

در اینجا Sftpc-dreER همه سلول‌های SCGB1A1 - SFTPC + AT2 را با ZsG (که AT2-tracer2 نامیده می‌شود) برچسب‌گذاری می‌کند، در حالی که Scgb1a1-creER SCGB1A1 + SFTPC - سلول‌های باشگاهی و SCGB1A1 + SFTPC + BASCها را با tdT، bb نشان می‌دهد (شکل 2a). تاموکسیفن برچسب‌گذاری کارآمد و اختصاصی ZsG سلول‌های AT2 را القا کرد، در حالی که BASCها به tdT (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4a-c) تبدیل شدند، که ویژگی سیستم را تایید می‌کند.

a، b، سیستم گزارشگر دوتایی: ZsG سلول‌های AT2 (SFTPC + SCGB1A1-) را برچسب‌گذاری می‌کند و tdT سلول‌های باشگاهی و BASC (a) را برچسب‌گذاری می‌کند، که امکان ردیابی سرنوشت سلول ZsG + AT2 پس از آسیب نایژه را فراهم می‌کند (b). نوک پیکان های قرمز در b نشان دهنده BASC ها هستند. ج , شماتیک طرح آزمایشی. d، ایمونوهیستوشیمی برای tdT، ZsG و SCGB1A1 در مقاطع ریه در 4 هفته پس از آسیب نفتالین (Naph) یا وسیله نقلیه. سر پیکان های سفید سلول های ZsG + SCGB1A1 + را نشان می دهد. e، تعیین کمیت سلول‌های کلاب SCGB1A1 در برونشیول‌های نشان‌دار شده توسط AT2-tracer2. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 5 موش.

f، رنگ آمیزی ایمنی برای tdT، ZsG، AGER و FOXJ1 در 4 هفته پس از نفتالین. نوک پیکان های سفید سلول های ZsG + FOXJ1 + یا ZsG + AGER + را نشان می دهد. g، تعیین کمیت سلول های AT2-tracer2 در برونشیول های بیان کننده SCGB1A1، SFTPC، AGER و FOXJ1. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 5 موش. h، نزدیکترین همسایه وزنی (WNN) تقریب منیفولد یکنواخت و طرح (UMAP) سنجش یکپارچه scRNA + برای داده‌های کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز (ATAC)، نشان‌دهنده خوشه‌هایی از سلول‌های AT1، AT2، باشگاه و مژه‌دار و توزیع آن‌ها در کنترل، آسیب نفتالین در 4 هفته و ناف

س i، آهنگ‌های ATAC-seq (شبه‌حجم) برای پویایی دسترسی کروماتین Sftpc، نشان‌دهنده بسته شدن تدریجی در سلول‌های باشگاه مشتق شده از AT2 در 4 هفته و 6 ماه در مقابل کنترل‌های ساکن. j - l، مقایسه سلول‌های باشگاهی بازسازی‌شده در 4 هفته (n = 86 سلول) و 6 ماه (n = 41 سلول) در برابر سلول‌های باشگاه درون‌زا (n = 526 سلول)، که نشان‌دهنده کروماتین اختصاصی سلول‌های AT2 (j) و اختصاصی سلول‌های باشگاهی (k) کروماتین (نمرات دسترسی متفاوت بر اساس 2) 1095 سلول) در مقابل سلول های باشگاهی و غنی سازی امضاهای ژن عملکردی مرتبط با کلاب (ترشحی و ایمنی؛ l).

نمودارهای جعبه، میانه (خط مرکزی)، صدک های 25 تا 75 (محدودیت جعبه) و 1.5 × محدوده بین چارکی (سبیل) را نشان می دهند. n = 1 ماوس. مقادیر P با استفاده از آزمون‌های کروسکال-والیس دو طرفه با تصحیح دان و بنجامینی-هوچبرگ تعیین شد. m، n، استراتژی ژنتیکی متقاطع (m)، امکان برچسب‌گذاری متمایز همزمان سلول‌های باشگاهی (tdT +، کلاب-ردیاب)، سلول‌های AT2 (ZsG +، AT2-tracer3) و BASCs (tdT + ZsG +، BASC-tracer) برای ردیابی نسب (n). o، طراحی آزمایشی. p، رنگ آمیزی ایمنی برای tdT، ZsG و SCGB1A1 در 4 هفته پس از آسیب نفتالین یا درمان وسیله نقلیه.

نوک پیکان های سفید و زرد به ترتیب سلول های ZsG + SCGB1A1 + و سلول های ZsG + tdT + SCGB1A1 + را نشان می دهند. q، تعیین کمیت سلول‌های SCGB1A1 + کلوپ برچسب‌گذاری شده به ترتیب توسط club-tracer، BASC-tracer و AT2-tracer3. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 5 موش. r، تعیین کمیت سلول های برونش نشاندار شده با AT2-tracer3 که SCGB1A1، SFTPC، AGER و FOXJ1 را بیان می کنند (تعداد = 5 موش). داده ها میانگین ± s.d هستند. s، نمودار سهم سلول های AT2-tracer3، club-tracer و BASC-tracer در بازسازی برونش. برای d، f و p، میله های مقیاس، 100 میکرومتر (نوارهای سفید) و 50 میکرومتر (نوارهای زرد).

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون‌های t دو دم ولش (club-tracer و BASC-tracer در q) و آزمون U Mann-Whitney (e و AT2-tracer3 در q) انجام شد. هر تصویر رنگ آمیزی ایمنی نماینده 5 موش است.

سپس ما تاموکسیفن و نفتالین را به موش ها تزریق کردیم و ریه ها را در 4 هفته (کوتاه مدت) و 6 ماه (بلند مدت) پس از آسیب تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 2c). ایمونوهیستوشیمی نشان داد که 60/5 ± 93/42 درصد از سلول‌های کلاب بازسازی‌شده ZsG + در 4 هفته بودند که منشأ AT2-tracer2 را تأیید می‌کند (شکل 2d,e). علاوه بر سلول‌های باشگاهی، این سلول‌های ZsG+ همچنین به AT2، AT1 و سلول‌های مژکدار در اپیتلیوم برونش کمک کردند (شکل 2f و داده‌های گسترده شکل 4d)، مطابق با یافته‌های AT2-tracer1 (شکل 1h،i).

سلول های برونش مشتق شده از AT2-tracer2 عمدتا کلابی (4.98 ± 62.31٪)، با سلول های کمتر AT2 (1.43 ± 9.45٪)، AT1 (6.63 ± 1.91٪) و مژه دار (0.13 ± 0.79٪) بودند (شکل 2g). پس از آسیب نفتالین، هیچ ساختار کانالی در دیواره برونش ایجاد نشد. در عوض، سلول‌های AT2 از طریق BADJ با افزایش پوشش اپیتلیال آنها در طول زمان ترمیم کمک کردند (داده‌های توسعه یافته شکل 4e,f). در 6 ماه پس از آسیب، اکثر سلول‌های برونشیولار مشتق از AT2 منقبض یا مژه‌دار بودند، اگرچه برخی هنوز SFTPC و AGER را بیان می‌کردند (داده‌های توسعه یافته شکل 4g).

پس از آسیب ثانویه نفتالین، سلول‌های کلاب مشتق از AT2 تکثیر شده و به سلول‌های مژکدار متمایز می‌شوند که به ترمیم برونش کمک می‌کند. تجزیه و تحلیل چند omics تک سلولی بیشتر نشان داد که سلول های کلوپ مشتق شده از AT2 با سلول های راه هوایی بومی در هر دو سطح رونویسی و اپی ژنتیک همگرا شده و ویژگی های عملکردی مربوطه را به دست آوردند (شکل 2h-l و شکل تکمیلی 1a).

امضای اپی ژنتیک اختصاصی AT2 به سرعت پس از تمایز متمایز کاهش یافت و از 4 هفته تا 6 ماه پس از آسیب کم ماند، در حالی که امضاهای اپی ژنتیکی و ترشحی/ایمنی اختصاصی سلول باشگاهی به تدریج در طول ترمیم افزایش یافت (شکل 2j-l). در مجموع، این داده ها نشان می دهد که سلول های AT2 در ترمیم اپیتلیال برونش پس از آسیب نفتالین شرکت می کنند (شکل 2b).

برای ارزیابی سهم نسبی سلول‌های باشگاهی، سلول‌های AT2 و اجداد BASC در بازسازی راه هوایی در یک مدل موش، ما از سیستم R26-TLR 3 دوگانه رکامبیناز استفاده کردیم، زیرا سلول‌های باشگاهی بازسازی‌شده ممکن است از گسترش سلول‌های باشگاهی، BASCها یا تمایز سلول‌های AT2 سرچشمه بگیرند. با استفاده از موش‌های Scgb1a1-creER;Sftpc-dreER;R26-TLR، ما سه جمعیت ردیابی مجزا ایجاد کردیم: کلاب ردیاب (tdT + ZsG - سلول‌های کلوپ)، AT2-tracer3 (سلول‌های tdT - ZsG + AT2) و BASC-ردیاب (tdT + Zsm, Fig.BASC2, Fig. رنگ‌آمیزی ایمنی برچسب‌گذاری خاص را تأیید کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4m-o).