سیگنال دهی مداوم استرس عصبی زمینه ساز فنوتیپ های سندرم آنجلمن است

سندرم آنجلمن یک اختلال عصبی رشدی شدید است که به دلیل از دست دادن UBE3A، ژنی که E3 یوبیکوئیتین لیگاز 1، 2 را کد می کند، ایجاد می شود. مکانیسم هایی که زمینه ساز سندرم آنجلمن است به خوبی شناخته نشده است، و به ویژه، ارتباط بین بسترهای UBE3A و فنوتیپ های بیماری نامشخص است 3 . در اینجا، با استفاده از جهش‌های افزایش و از دست دادن عملکرد در UBE3A 4، 5 همراه با پروتئومیکس بی طرفانه، نشان می‌دهیم که آسپاراژین سنتتاز (ASNS) هدف UBE3A است. ما دریافتیم که فراوانی پروتئین ASNS در مغز موش‌های Ube3a-null و در نورون‌های انسانی افزایش یافته است.

اصلاح ژنتیکی فراوانی بیش از حد ASNS میکروسفالی و بسیاری از نقایص رفتاری را نجات می دهد. تجزیه و تحلیل های مولکولی دقیق نشان می دهد که فراوانی بیش از حد ASNS سیگنال دهی استرس را فعال می کند و باعث کاهش جهانی در سنتز پروتئین عصبی می شود. نتایج ما نشان می‌دهد که از دست دادن UBE3A نورون‌ها را در حالت استرس مداوم به دام می‌اندازد و رشد نورون‌ها را در طول دوره‌های حساس رشدی متوقف می‌کند. علاوه بر این، نتایج ما نشان می‌دهد که هدف قرار دادن ASNS و پاسخ استرس می‌تواند پتانسیل درمانی در سندرم آنجلمن را حفظ کند.

سندرم آنجلمن (AS) در 1:20000 تولد رخ می دهد و با ناتوانی ذهنی، تاخیر رشد، صرع، میکروسفالی، ویژگی های بدشکلی صورت و مشخصات رفتاری منحصر به فرد مشخص می شود. این بیماری در اثر حذف یا جهش نسخه ارثی مادرانه UBE3A ایجاد می شود، ژنی که همچنین با اختلالات خلقی 7، 8، اوتیسم 4، 5، 7 و سرطان 9، 10 مرتبط است. به طور گسترده پذیرفته شده است که فنوتیپ ها در AS به دلیل اختلال در تنظیم بسترهای UBE3A در طول توسعه ایجاد می شوند.

با این حال، اگرچه بسترهای متعددی پیشنهاد شده است 3، ایجاد ارتباط آنها با فنوتیپ های AS دشوار است و درک مکانیکی محققان از این اختلال را محدود می کند.

UBE3A عضو موسس خانواده لیگازهای یوبیکوئیتین E3 HECT (همولوگ با پایانه E6-AP C) است که همگی دارای یک دامنه HECT حفاظت‌شده هستند که شامل ماشین آلات بیوشیمیایی لازم برای پذیرش یوبیکوئیتین فعال از آنزیم‌های E2 و انتقال آن به پروتئین‌های هدف است. بیان UBE3A به‌طور خاص در نورون‌ها حک می‌شود، به طوری که تنها آلل ارثی مادر بیان می‌شود، با آلل پدری که از نظر اپی ژنتیکی خاموش می‌شود.

این مکانیسم چاپ، همراه با بسیاری از فنوتیپ‌های مرتبط با بیماری، در موش‌های مدل AS که فاقد نسخه مادری Ube3a هستند (Ube3a m-/p +) 12 حفظ شده است. این فنوتیپ ها شامل نقص حرکتی و رفتاری و میکروسفالی، برجسته ترین نقص عصبی آناتومیک در AS 13 است. میکروسفالی در بدو تولد در موش ها وجود ندارد، اما پس از تولد به دست می آید، که ناشی از نارسایی رشد عصبی است که منجر به درختان دندریتیک کوتاه تر و ساده تر و آکسون های با قطر کمتر می شود.

پاسخ استرس یکپارچه (ISR) یک مسیر حفاظت شده است که به حفظ هموستاز سلولی در پاسخ به محرک های مضر، از جمله استرس پروتئوتوکسیک، محرومیت از مواد مغذی، عفونت ویروسی و استرس اکسیداتیو کمک می کند. این محرک ها توسط چهار کیناز تخصصی (PERK، GCN2، PKR و HRI) که در فسفوریلاسیون زیرواحد α فاکتور 2 شروع ترجمه یوکاریوتی (p-eIF2α) برای سرکوب سنتز پروتئین جهانی و شروع برنامه های رونویسی جبرانی همگرا می شوند، حس می شوند.

آسپاراژین سنتتاز (ASNS) یک آنزیم متابولیک حفاظت شده است که توسط فاکتور رونویسی ATF4 در پاسخ به محرومیت از اسید آمینه القا می شود. ASNS سنتز آسپاراژین و گلوتامات وابسته به ATP را از آسپارتات و گلوتامین کاتالیز می کند، اما نقش آن در رشد عصبی هنوز به خوبی شناخته نشده است.

برای شناسایی سوبستراهای UBE3A، ما از خطوط سلولی بیانگر جهش‌های افزایش عملکرد (GOF) و از دست دادن عملکرد (LOF) استفاده کردیم و آن‌ها را در معرض برچسب‌گذاری ایزوتیپ پایدار توسط اسیدهای آمینه در کشت سلولی (SILAC)، باقیمانده تریپتیک (Tryptic immunoaffinity) و غنی‌سازی انبوه میل ترکیبی (Glyspectry-Glypurdi) قرار دادیم. 1a). ما این آزمایش را در چهار تکرار انجام دادیم و پروتئین هایی را شناسایی کردیم که سطوح یوبی کوئیتیناسیون آنها حداقل 20 درصد در سلول هایی که جهش بیش فعال کننده در UBE3A را بیان می کردند غنی شده بود (جدول تکمیلی 1).

به دلیل مسائل فنی در این آزمایش (برای جزئیات بیشتر به روش‌ها مراجعه کنید)، تعداد کل پروتئین‌های شناسایی‌شده در تکرارها متفاوت بود. با این حال، مقایسه پروتئین‌های منحصربه‌فرد در بین تکرارها به ما امکان داد تا فهرستی از 23 پروتئین را که می‌توانند به عنوان بسترهای بالقوه عمل کنند، تهیه کنیم (شکل 1b). در این فهرست، سوبستراهای جدید و همچنین پروتئین‌های زیادی وجود داشت که به UBE3A متصل می‌شوند یا توسط Ubiquitinated می‌شوند (شکل 1c).

a، شماتیک گردش کار SILAC در سلول های HEK293T که جهش یافته های LOF یا GOF UBE3A را بیان می کنند. b، نمودار ون که تعداد پروتئین های شناسایی شده را در آنالیز کروماتوگرافی مایع-طیف سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS/MS) نشان می دهد. مقایسه آزمایش‌های انجام‌شده در چهار تکرار، 23 بستر رایج (n=4 تکرار بیولوژیکی) را شناسایی کرد. ج، فهرست سوبستراهای احتمالی UBE3A و نام ژن آنها که در صفحه ما شناسایی شده است. سبز نشان دهنده سوبستراهای شناخته شده UBE3A یا پروتئین های در حال تعامل است. پررنگ نشان دهنده زیرلایه هایی است که توسط اعتبار سنجی ثانویه تایید شده اند.

d، e، وسترن بلات (d) و کمی سازی (e) پروتئین های کاندید از سلول های HEK293T ترانسفکت شده با WT MYC-UBE3A یا MYC-UBE3A (LD). داده ها میانگین ± s.e.m هستند. اهمیت با تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه دو طرفه (ANOVA) با آزمون توکی برای مقایسه های چندگانه تعیین شد. مقادیر دقیق P نشان داده شده است. f، نمودار ون که همپوشانی سوبستراهای احتمالی شناسایی شده در این مطالعه را با پروتئین هایی که با UBE3A در سلول های HEK293T همزمان رسوب ایمنی می کنند را نشان می دهد.

g، نمودار ون که سوبستراهای UBE3A پیشنهادی را در بین پروتئین‌های تنظیم‌شده بالا نشان می‌دهد که با طیف‌سنجی جرمی از دو خط نورون AS مشتق‌شده از سلول‌های بنیادی پرتوان القایی شناسایی شده‌اند. پروفایل های پروتئین کامل در جدول تکمیلی 2 نشان داده شده است. همه اندازه های نمونه (n) نشان دهنده تکرارهای بیولوژیکی مستقل هستند: n = 4 در b، n = 3 (ASNS) و n = 4 (DNA-PKc) در e.

برای تایید این نامزدها، ابتدا فراوانی پروتئین را با تجزیه و تحلیل وسترن بلات در سلول‌های HEK293T که (1) نوع وحشی (WT) یا UBE3A مرده لیگاز (C820A؛ UBE3A (LD)) و (2) WT UBE3A یا GOF UBE3A (T485A) را بیان می‌کنند، مقایسه کردیم. در هر دو آزمایش، فراوانی زیرواحد کاتالیزوری پروتئین کیناز وابسته به DNA (DNA-PKc)، ASNS و پروتئین ریبوزومی RPL3 تحت تأثیر UBE3A قرار گرفت به گونه‌ای که این پروتئین‌ها زیرلایه‌های UBE3A هستند (شکل 1d,e و داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a-d).

دوم، ما سلول‌های ناک داون (KD) تولید کردیم که به طور پایدار یک RNA سنجاق سر کوتاه (shRNA) را که UBE3A (UBE3A KD) را هدف قرار می‌داد، بیان می‌کردند، و فراوانی سوبسترای کاندید را تحلیل کردیم. کاهش متوسط ​​UBE3A (25%) باعث افزایش فراوانی ASNS، DNA-PKc و RPL3 در این سلول ها شد (داده های توسعه یافته شکل 1e,f). سوم، ما سلول ها را با مهارکننده پروتئازوم MG132 (15 میکرومولار، 12 ساعت) برای آزمایش وابستگی پروتئازوم درمان کردیم. MG132 اثر WT UBE3A را بر روی فراوانی DNA-PKc و ASNS معکوس کرد، اما هیچ تاثیری بر RPL3 نداشت، و نشان می‌دهد که تغییرات ناشی از UBE3A در RPL3 مستقل از پروتئازوم است (داده‌های توسعه یافته شکل 1g,h).

ما در مرحله بعد نتایج صفحه نمایش خود را با یافته های آزمایش هم-ایمنی قبلی با استفاده از UBE3A(LD) که در سلول های HEK293T بیان شده بود مقایسه کردیم. 15 نفر از 23 نامزد، از جمله ASNS و DNA-PKc، نیز به عنوان شرکای اتصال در این آزمایش قبلی شناسایی شدند (شکل 1f). در نهایت، ما لیستی از 55 بستر پیشنهادی UBE3A، از جمله ASNS و DNA-PKc را با مجموعه داده‌های گزارش شده قبلی از پروتئین‌های تنظیم‌شده بالا که در دو خط نورون AS مشتق شده از بیمار مستقل شناسایی شده‌اند، مقایسه کردیم (جدول تکمیلی 2).

از 532 پروتئینی که معمولا در هر دو خط تنظیم مثبت می‌شدند، تنها 4 سوبسترای پیشنهادی در این لیست قرار داشتند، از جمله انکسین A1 19، پراکسی‌ردوکسین 120، PEG106 و ASNS (شکل 1g). از آنجا که هر مرحله اعتبار سنجی به ASNS اشاره داشت، ما تجزیه و تحلیل خود را از این پروتئین گسترش دادیم.

ASNS از یک دامنه هیدرولیز گلوتامین و یک دامنه آسپاراژین سنتاز تشکیل شده است که منعکس کننده دو فعالیت کاتالیزوری آن است (داده های توسعه یافته شکل 2a). ما ابتدا آزمایش‌های رسوب ایمنی مشترک را انجام دادیم و دریافتیم که UBE3A بیان شده بیش از حد با ASNS درون‌زا در سلول‌های HEK293T، مطابق با نتایج طیف‌سنجی جرمی قبلی 18، هم‌تنظیم می‌شود (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2b). ما در مرحله بعدی یک واکنش یوبیکوئیتین آزمایشگاهی متشکل از ASNS نوترکیب انسانی، UBE1 (E1)، UBCH7 (E2)، UBE3A، یوبیکوئیتین و ATP را بازسازی کردیم.

ما دریافتیم که UBE3A برای کاتالیز کردن تشکیل زنجیره‌های یوبیکوئیتین با وزن مولکولی بالا در ASNS و در عین حال کاهش همزمان سطح ASNS اصلاح نشده مورد نیاز است (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2c-e). در نهایت، ما یوبی‌کوئیتیناسیون ASNS را در سلول‌های UBE3A -KD که ASNS با HA و یوبیکوئیتین برچسب‌گذاری شده با پرچم را بیان می‌کنند مورد بررسی قرار دادیم و با MG132 (30 میکرومولار) به مدت 1 ساعت تحت درمان قرار گرفتیم. کاهش متوسط ​​در UBE3A باعث کاهش متناسب 25 درصدی در یوبی کوئیتیناسیون ASNS شد (داده های توسعه یافته شکل 2f,g)، که نشان می دهد UBE3A آنزیم اصلی E3 است که ASNS را برای تخریب پروتئازومی در این سلول ها هدف قرار می دهد.

آزمایش پروتئومیکس ما پنج سایت کاندید ubiquitination را در ASNS شناسایی کرد: K83 و K168، که به خوبی حفظ شده‌اند و در حوزه هیدرولیز گلوتامین قرار دارند. و K467، K478 و K504، که بسیار حفاظت شده هستند و در دامنه ASNS یافت می شوند (Extended Data شکل 2h). برای تأیید یوبی کوئیتیناسیون وابسته به UBE3A در این سایت‌ها، ما جهش‌های ASNS لیزین به آرژنین (KR) تولید کردیم و آنها را با یوبیکوئیتین و UBE3A برچسب‌گذاری شده با پرچم به سلول‌های HEK293T انتقال دادیم.

در حالی که یوبیکوئیتیناسیون جهش یافته های K83R و K168R شبیه آنچه در WT ASNS مشاهده شد، برای جهش یافته های K467R، K478R و K504R کاهش یا تغییر یافت (داده های توسعه یافته شکل 2i). در آزمایش‌های حالت پایدار، WT UBE3A فراوانی WT ASNS و جهش‌یافته‌های K83R و K168R را کاهش داد، اما هیچ تغییری برای جهش‌یافته‌های K467R، K478R و K504R مشاهده نشد.

از آنجایی که یوبی کوئیتیناسیون تخریبی به ندرت توسط یک لیزین هدایت می شود، نمی توانیم تغییرات در همکاری، پیوند ubiquitination یا سینتیک ubiquitination ناشی از جهش های K467R، K478R و K504R را رد کنیم. با این وجود، این نتایج به شدت نشان می دهد که یوبی کوئیتیناسیون در حوزه آسپاراژین سنتاز برای تخریب ASNS بسیار مهم است.

ما در مرحله بعد مقررات ASNS با واسطه UBE3A را در داخل بدن با تجزیه و تحلیل سطوح پروتئین ASNS و ubiquitination در مغز موش‌های Ube3a m-/p + (به عنوان موش Angelman) ارزیابی کردیم. در بافت هیپوکامپ، ASNS ایمونوفریت‌شده در موش‌های آنجلمن در مقایسه با کنترل‌های WT، حدود 50 درصد کاهش در یوبی‌کوئیتیناسیون نشان داد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a,b). به طور مشابه، فراوانی ASNS در هیپوکامپ (130.63 ± 3.92٪ بالاتر از WT) و قشر (114.55 ± 3.60٪) با روند در مغز میانی افزایش یافت، اما در نمونه های مخچه افزایش یافت (داده های توسعه یافته شکل 3c).

این تغییرات به دلیل افزایش رونویسی Asns نبود، زیرا PCR کمی (qPCR) RNA هیپوکامپ نشان داد که هیچ تفاوتی در سطوح mRNA Asns وجود ندارد (داده های توسعه یافته شکل 3d). در نهایت، سطوح پروتئین ASNS در لیزهای هیپوکامپ موش‌های دارای جهش GOF T485A معادل مادری در UBE3A (mT503A در موش‌ها 21) کاهش ظریف اما ثابتی را نشان داد (داده‌های توسعه یافته شکل 3e,f). در مجموع، آزمایش‌های بیوشیمیایی ما نشان می‌دهد که UBE3A ASNS را هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن یوبی‌کوئیتین می‌کند.

ASNS به طور گسترده در بافت ها و انواع سلول بیان می شود. با این حال، بیان آن در مغز به خوبی مشخص نشده است. ما رونوشت‌های Asns را در نورون‌های گلوتاماترژیک موش، نورون‌های GABAergic و سلول‌های غیر عصبی با استفاده از توالی‌یابی RNA تک سلولی کل مغز (scRNA-seq) و داده‌های رونویسی فضایی تجسم کردیم. قابل توجه، Asns به طور گسترده در هر دو نورون های تحریکی و مهاری بیان شد، اما عمدتا در سلول های غیر عصبی وجود نداشت (شکل 2a).

هنگامی که ما این تجزیه و تحلیل را به زیر کلاس های سلولی در سراسر مغز گسترش دادیم، متوجه شدیم که Asns در اکثر زیر کلاس های عصبی بیان می شود اما تقریبا در تمام سلول های غیر عصبی غیرقابل تشخیص است (شکل 2b و جدول تکمیلی 3). ما بیشتر این را با استفاده از یک مجموعه داده scRNA-seq منتشر شده از هیپوکامپ موش 23 تأیید کردیم، که دوباره نشان داد که بیان Asns در نورون‌ها غنی شده است (شکل 2c)، الگویی که با چاپ اختصاصی نورون Ube3a مطابقت دارد.

a، نقشه‌های حرارتی فضایی رونویسی که بیان Asns را در نورون‌های گلوتاماترژیک، نورون‌های GABAergic و سلول‌های غیر عصبی در بخش‌های تاجی نشان می‌دهند. b، تجزیه و تحلیل خوشه‌ای زیرگروه سلولی کل مغز که غنی‌سازی Asns در نورون‌ها را نشان می‌دهد. چول، کولین؛ دوپا، دوپامین؛ گابا، γ-آمینوبوتیریک اسید؛ گلوت، گلوتامات؛ گلیک، گلیسین؛ هیست، هیستامین؛ NA، در دسترس نیست. نورا، نورآدرنالین؛ سرو، سروتونین ج، RNA تک سلولی از هیپوکامپ موش که غنی‌سازی Asns را در نورون‌ها نشان می‌دهد. MG، میکروگلیا؛ PVM، ماکروفاژهای اطراف عروقی.

d، تصاویری از ایمونوفلورسانس ASNS در نیم برش های تاج از موش های P0، P10 و P21 WT. جعبه های چین دار مناطقی را نشان می دهند که در سمت راست با بزرگنمایی بالاتر نشان داده شده اند. میله های مقیاس، 200 میکرومتر. e، بیان ASNS در بخش تاجی مغز P21 WT. AM، آمیگدال؛ CA2 و CA3، cornu ammonis 2 و 3. CP، caudoputamen; CTX، قشر؛ DG، شکنج دندانه دار؛ HPF، هیپوکامپ؛ HY، هیپوتالاموس؛ PF، هسته parafascicular; PIR، ناحیه پیریفرم؛ STN، هسته ساب تالاموس؛ TH، تالاموس; ZI، زونا اینسرتا. میله های مقیاس، 200 میکرومتر.

f، کولوکالیزاسیون ASNS با نورون های 5-HT مثبت در هسته رافه پشتی، قسمت پشتی (DRd) و نورون های TH-مثبت در جسم سیاه پارس فشرده (SNpc) در موش P43 WT. میله های مقیاس، 120 میکرومتر. g , کمی سازی f . h، برآمدگی های کانفوکال که ASNS را در قشر P21 WT و هیپوکامپ با نشانگرهای سلولی نشان می دهد: GFAP (آستروسیت ها)، IBA1 (میکروگلیا) و NeuN (نرون ها). تصاویر ادغام شده شامل DAPI (آبی) است. میله های مقیاس، 100 میکرومتر. i، j، کمیت شدت ASNS در قشر (i) و هیپوکامپ (j). برای همه پانل های کمی، داده ها میانگین ± s.e.m هستند.

معنی‌داری با استفاده از آزمون t جفت نشده دو دنباله تعیین شد. مقادیر دقیق P نشان داده شده است. همه اندازه های نمونه (n) نشان دهنده تکرارهای بیولوژیکی مستقل (موش): n = 3 در هر سن در d. n = 3 موش در e , g ; n = 5 موش (سلول های NeuN + و GFAP + در قشر) و n = 6 موش (سلول های NeuN + و IBA1 + در قشر) در i. n = 3 موش در تمام جمعیت ها در j.

برای توصیف سطوح پروتئین ASNS در محل، ما یک آنتی بادی علیه پروتئین ASNS موش را با استفاده از سلول‌های Neuro2a موش که با پلاسمیدی که EGFP را بیان می‌کند همراه با یک shRNA که Asns موش را هدف قرار می‌دهد، ترانسفکت شده‌اند، تأیید کردیم. ما ویژگی آنتی بادی را از طریق آزمایش های ایمونوفلورسانس تایید کردیم (داده های توسعه یافته شکل 4a-d). ما ابتدا پروتئین ASNS را در مغز در حال رشد با تمرکز بر قشر و هیپوکامپ بررسی کردیم. در موش‌ها در روز 0 پس از تولد (P0)، رنگ‌آمیزی ASNS در لایه‌های عصبی قشر برجسته‌تر بود.

اجسام سلولی و دندریت های آپیکال به طور برجسته نشاندار شده بودند، در حالی که الیاف آکسون برچسب گذاری ظریفی را نشان می دادند و رنگ آمیزی عمدتا در مناطق پرولیفراتیو مجاور بطن های جانبی وجود نداشت (شکل 2d). در P10، ایمونورنگ‌پذیری ASNS در سراسر قشر و هیپوکامپ منتشر شد، با برچسب‌گذاری جسمی برجسته‌تر در نورون‌های قشر عمیق‌تر و لایه‌های هرمی هیپوکامپ در حال توسعه.

در P21، رنگ آمیزی ASNS متناوب در سراسر مغز بود و در لایه های عمیق قشر، شکنج دندانه دار، لایه های عصبی هیپوکامپ، آمیگدال و تالاموس غنی شد (شکل 2d,e ). در مناطق دیگر، ASNS به شدت بیشتر سروتونین (5-هیدروکسی تریپتامین؛ 5-HT)-مثبت نورون های سروتونرژیک رافه پشتی (5.77 ± 88.20 درصد از سلول ها) و زیرمجموعه ای از تیروزین هیدروکسیلاز (TH) -مثبت نورون های دوپامینرژیک دوپامینرژیک (6.6±2. 3.83٪ از سلول ها)، نشان می دهد که پروتئین ASNS به طور ناهمگن در سراسر مغز حفظ می شود (شکل 2f،g).

برای آزمایش اینکه آیا این سلول‌های غنی‌شده با ASNS نورون هستند، ما نشانگرهای نورون‌ها (NeuN)، آستروسیت‌ها (GFAP) و میکروگلیا (IBA1) در قشر و هیپوکامپ را رنگ‌آمیزی کردیم. تقریبا تمام سلول‌های ASNS مثبت با NeuN هم‌زمان محلی‌سازی شدند، که تأیید می‌کند رونوشت و پروتئین ASNS عمدتا عصبی هستند (شکل 2h-j). بعدا با بررسی ASNS در سلول‌های بازدارنده لایه شرقی و لایه تابشی، پرسیدیم که آیا برچسب‌گذاری ناهمگن تصادفی یا سیستماتیک است. اگر تصادفی باشد، سلول‌های غنی‌شده با ASNS باید به طور مساوی در زیر کلاس‌های نورون بازدارنده نمایش داده شوند.

اگر سیستماتیک باشد، پس غنی سازی ASNS باید به سمت زیر کلاس های خاص سوگیری شود. ما برش های مغز را برای ASNS و چندین نشانگر پرکاربرد بین نورون ها، از جمله پاروالبومین (PV)، سوماتوستاتین (SST)، کالرتینین (CR) و نوروپپتید Y (NPY) رنگ آمیزی کردیم (داده های توسعه یافته شکل 4e-g). شایان ذکر است، تمام سلول‌های ASNS مثبت NPY مثبت بودند (PV، 6.91 ± 56.94 درصد؛ SST، 3.82 ± 57.5 درصد؛ CR، 12.43 ± 22.62 درصد؛ NPY، 100 درصد، که نشان می‌دهد که ASNS دارای طبقه‌بندی غنی‌سازی شده است، اما عملکرد سلول‌ها را حفظ نمی‌کند.

در نهایت، ما پرسیدیم که آیا از دست دادن UBE3A فراوانی پروتئین ASNS را در جمعیت‌های عصبی انتخاب شده افزایش می‌دهد یا خیر. با استفاده از ایمونوفلورسانس، فراوانی ASNS را در نورون‌های بین‌اعصاب NYP مثبت و نورون‌های تحریک‌کننده CaMKIIα مثبت در هیپوکامپ بررسی کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4h-k). ما شاهد افزایش ظریف در سلول‌های تحریک‌کننده و مهارکننده بودیم که نشان می‌دهد از دست دادن UBE3A بر فراوانی ASNS به‌جای جمعیت‌های سلولی خاص تأثیر می‌گذارد.

ما بعدا تعجب کردیم که آیا اصلاح فراوانی بیش از حد ASNS می تواند بر فنوتیپ های نابجا در موش های Angelman تأثیر بگذارد یا خیر. تاکنون تنها یک خط موش هیپومورفیک Asns منتشر شده است 24 . بنابراین ما یک خط تهی جدید ایجاد کردیم که حاوی یک جهش مزخرف با هدف CRISPR-Cas9 در Asns است. ما نرهای Asns -null هتروزیگوت (Asns +/-) را با ماده‌های Ube3a تهی پدری (Ube3a m +/ p-) تلاقی کردیم تا چهار ژنوتیپ تولید کنیم: WT (Ube3a m +/ p +، Asns +/+)، Het (Ube3a m +/ p +)، M-3a m +/p +، Asns +/-be +/+) و نجات (Ube3a m −/ p +، Asns +/-) (شکل 3a).

همانطور که انتظار می رفت، وسترن بلات و تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی نشان داد که موش های Het تقریبا 50 درصد از سطوح پروتئین WT ASNS را داشتند و فراوانی ASNS در موش های Rescue به سطوح نزدیک به WT بازگشت (شکل 3b و داده های توسعه یافته شکل 5a-c).

الف , طرح پرورش موش. b، وسترن بلات و تعیین کمیت ASNS در نیمکره های مغز P21 (درصد نسبت به WT). ج، جدول زمانی آزمون رفتار. د، وزن بدن موش ماده در P0-P150. e، f، زمان مرکز در سنجش میدان باز (e) و مسافت طی شده در طول دقیقه 50-60 (f) در موش‌های 8 هفته‌ای. g، روش بستن اندام عقبی. h، i، سنجش دفن مرمر: تصاویر معرف (h) و کمیت (i).

برای همه پانل های کمی، داده ها میانگین ± s.e.m هستند، به جز g , i که در آن نمودارهای جعبه صدک های 25 تا 75 (مرز جعبه)، میانه (خط مرکزی) و محدوده حداقل به حداکثر (سبیل) را نشان می دهند. در f , g , i نمادهای جامد نشان دهنده موش ماده و نمادهای باز نشان دهنده موش های نر هستند. اهمیت توسط آنالیز واریانس دوطرفه دو طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی برای همه تحلیل‌ها تعیین شد. مقادیر دقیق P نشان داده شده است.

تمام اندازه های نمونه (n) نشان دهنده تکرارهای بیولوژیکی مستقل (موش): در b، n = 3 (WT، Het و Rescue). n = 4 (فرشته مرد)؛ در d، P0 (n = 5)، P10 (n = 10 WT و Angelman؛ n = 20 Het و Rescue)، P21 (n = 10 WT؛ n = 13 Angelman؛ n = 11 Het و Rescue)، P90 (n = 15 WT؛ n = 15 WT؛ n = 2 و n2 او P150 (n = 12 WT؛ n = 22 Angelman؛ n = 17 Het and Rescue).

برای سنجش رفتاری (e – i)، اندازه نمونه به شرح زیر است: n = 71 در کل در e , f (WT: 5 مرد، 11 زن؛ فرشته: 5 مرد، 8 زن؛ Het: 12 مرد، 7 زن؛ نجات: 12 مرد، 11 زن). n = 138 مجموع بر حسب گرم (WT: 12 مرد، 20 زن؛ فرشته: 15 مرد، 11 ماده؛ Het: 16 مرد، 25 زن؛ نجات: 22 مرد، 17 زن). n = 138 کل در h , i (WT: 12 مرد، 21 زن؛ فرشته: 15 مرد، 11 زن؛ Het: 16 مرد، 24 زن؛ نجات: 22 مرد، 17 زن).