شبکه های شش ضلعی کدگذاری شده با توالی در نانوفیبریل های پپتیدی چند کاناله

پیچیدگی ساختاری در ماده بیولوژیکی از اطلاعات مولکولی ناشی می شود که مجموعه فوق مولکولی را در مقیاس های طولی 1، 2، 3 رمزگذاری می کند. در اینجا ما نشان می‌دهیم که حداقل پپتیدهای نه باقیمانده می‌توانند نقوش تعامل جانبی گسسته را رمزگذاری کنند که سازمان‌های فوق مولکولی را هدایت می‌کنند. این نقوش منافذ شش ضلعی ایجاد می کنند و به صورت سلسله مراتبی به نانوفیبریل های چند کانالی با توپولوژی تعریف شده تبدیل می شوند.

دوزیستی کدگذاری شده با توالی، یک دایمر متقاطع، یک نقطه وارونگی و یک اتصال تریمریک را ترکیب می کند تا رابط های مکملی ایجاد کند که رشد جانبی را به انباشته شدن محوری پیوند می دهد، و شبکه های لانه زنبوری با نانوکانال های پیوسته تقریبا 5 نانومتری قابل دسترسی با حلال را ایجاد می کند. میکروسکوپ کریو الکترونی معماری فوق مولکولی را حل می کند و نشان می دهد که تقارن شبکه و هندسه منافذ در انواع مختلف حفظ می شوند. آشفتگی های سیستماتیک قوانین توالی ساختاری را ایجاد می کند که موقعیت باقیمانده را به تقارن فوق مولکولی، انتشار شبکه و توپولوژی کانال مرتبط می کند.

شبیه‌سازی دینامیک مولکولی و طیف‌سنجی ارتعاشی نشان می‌دهد که کانال‌ها در دسترس آب باقی می‌مانند و هیدراتاسیون قابل تنظیم توالی را نشان می‌دهند. این یافته‌ها نشان می‌دهد که یک سلسله‌مراتب برهمکنش حداقلی و رمزگذاری‌شده با توالی می‌تواند نظم فوق مولکولی دوربرد را برنامه‌ریزی کند، و یک چارچوب کلی برای اینکه پپتیدهای کوتاه چگونه می‌توانند معماری‌های پیچیده و با تقارن تعریف‌شده را رمزگذاری کنند، ارائه می‌کند.

مواد بیولوژیکی پیچیدگی عملکردی را از اطلاعات مولکولی می گیرند که ساختار سه بعدی و سازماندهی سلسله مراتبی آنها را در مقیاس های طولی رمزگذاری می کند. پلی پپتیدها یک فضای طراحی شیمیایی غنی را ارائه می دهند 13، 14، 15، و فیبریل های آمیلوئید غنی از ورقه β یکی از رایج ترین حالت های فوق مولکولی آنها را با نقش های مختلف از ذخیره سازی هورمون تا تجمع پاتولوژیک 16، 17، 18 نشان می دهند.

پیشرفت‌های اخیر در میکروسکوپ کریو الکترونی (cryo-EM) این مجموعه‌ها را با وضوح بالا نشان داده است، ساختارهای اتمی آن‌ها را در حالت هیدراته حل می‌کند 17، 18، و بسته‌بندی و چندشکلی موتیف‌های بتا متقاطع را آشکار می‌کند.

بیشتر مجموعه‌های پپتیدی به‌صورت فیبریل‌های یک‌بعدی دراز می‌شوند که رابط‌های جانبی آن‌ها چند شکلی است و بنابراین طراحی آن دشوار است، و از کاشی‌کاری کنترل‌شده به شبکه‌های با ابعاد بالاتر جلوگیری می‌کند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a). رشد سلسله مراتبی قابل برنامه ریزی در پروتئین های مارپیچ 19، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26 و سیستم های تقلیدی کلاژن از طریق رابط های بزرگ از پیش سازمان دهی شده 27، 28 به دست آمده است، در حالی که پپتیدهای پپتید از کانال های پشتی حلقه ای متقابل استخوانی دوباره تشکیل شده اند. پیش سازمانی 29، 30، 31، 32، 33، 34.

در مقابل، تشکیل شبکه دو یا سه بعدی کنترل شده از حداقل پپتیدهای بتا ورق خطی نادر است 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12. در نتیجه، یک چارچوب هندسی هدایت‌شده برای معماری‌های چند کانالی قابل برنامه‌ریزی از توالی‌های کوتاه بتا ورق خطی گریزان باقی مانده است.

در اینجا نشان می‌دهیم که غیرآپپتیدهای آمفی‌فیلیک موتیف‌های برهم‌کنش گسسته‌ای را کد می‌کنند که تشکیل منافذ شش‌ضلعی را هدایت می‌کنند، که به صورت سلسله مراتبی به نانوفیبریل‌های چند کانالی قابل انبساط جانبی تبدیل می‌شوند: یک دایمر متقاطع بتا که واسطه رشد جانبی و محوری است، یک اتصال سه‌گانه که اتصال جانبی را رمزگذاری می‌کند، و یک اتصال جانبی را رمزگذاری می‌کند. نقوش (شکل 1a) برای ایجاد رابط های مکمل که سازمان جانبی را به انباشته شدن محوری مرتبط می کند.

Cryo-EM، اغتشاش توالی، شبیه‌سازی دینامیک مولکولی و طیف‌سنجی ارتعاشی نشان می‌دهد که چگونه این نقوش با انباشته شدن محوری، کاشی‌کاری جانبی و هیدراتاسیون کانال وابسته به دنباله همراه می‌شوند. با هم، این نتایج نشان می‌دهد که حداقل موتیف‌های برهمکنش رمزگذاری‌شده با توالی می‌توانند تقارن سوپرمولکولی و رشد شبکه سلسله مراتبی را برنامه‌ریزی کنند و نانوفیبریل‌های پپتیدی چند کاناله را از توالی‌های خطی کوتاه ممکن می‌سازند.

طراحی مدولار خانواده پپتید DILT که رابط تشکیل دهنده متقاطع β-دایمر، باقیمانده وارونگی و رابط تشکیل دهنده تریمریک-اتصال را نشان می دهد که با هم رابط های محوری و جانبی مکمل را رمزگذاری می کنند. پتانسیل سطح قطبی و آپولار به ترتیب با رنگ زرد و قرمز نشان داده شده است. کره زرد نشان دهنده باقی مانده وارونگی است. b، دایمرهای متقاطع β، رابط اصلی انباشتگی و تداعی ورق β را تعریف می‌کنند، در حالی که اتصالات تریمر اتصال جانبی را از طریق یک هسته آبگریز مشترک و تعاملات تثبیت‌کننده قطبی فراهم می‌کنند.

ج، جفت شدن انباشته شدن دایمر و تشکیل اتصال، یک منفذ شش ضلعی ایجاد می کند که در امتداد محور فیبریل منتشر می شود تا یک نانوکانال شش ضلعی را تشکیل دهد و از رشد جانبی به شبکه های لانه زنبوری چند کاناله مداوم پشتیبانی می کند که هندسه منافذ را حفظ می کند.

خانواده توالی تریمر دایمر - وارونگی - قفل (DILT) یک هندسه برهمکنش را رمزگذاری می کند که تقارن نانو کانال شش ضلعی و تشکیل شبکه لانه زنبوری را هنگام مونتاژ ممکن می کند. این طرح پپتید 9 باقیمانده یک بخش تشکیل دهنده متقاطع β-دایمر، یک باقیمانده وارونگی مرکزی و یک اتصال trimeric را ترکیب می کند (شکل 1a و شکل تکمیلی 1).

در نمونه اولیه DILT1 (K1–V2–K3–V4–S5–Q6–I7–N8–M9)، موتیف آمفی‌فیل N-ترمینال K1–V2–K3–V4 جفت‌های متقاطع بتا رو در رو با بسته‌بندی آبگریز را ترویج می‌کند، در نتیجه سازماندهی آبگریز آبگریز را از طریق سطوح تماس پشتی آبگریز برای سطح تماس با محوری آبگریز تعریف می‌کند. این بخش از خانواده 35 MAX1 الیگوپپتید متقابل تشکیل دهنده β الهام گرفته شده است (داده های توسعه یافته شکل 1b). بخش C ترمینال Q6-I7-N8-M9 یک تعامل trimeric را کد می کند، که در آن زنجیره های جانبی قطبی پیوندهای هیدروژنی جهت دار را ایجاد می کنند و باقی مانده های آبگریز یک هسته مشترک را تشکیل می دهند.

این بخش تشکیل‌دهنده اتصال بر اساس توالی آمیلوئیدوژنیک مشتق از گلیکوپروتئین HIV (gp120) و الیگوپپتیدهای متقابل بتا بهینه‌سازی‌شده مرتبط با آن بود. طراحی اتصال تریمریک در خانواده DILT منطق فیزیکوشیمیایی مشاهده شده در آمیلوئیدهای تریمریک طبیعی را تطبیق می دهد.

باقیمانده‌های به‌هم‌پیوسته، هندسه‌ای به شکل پروانه‌ای مسطح ایجاد می‌کنند، باقی‌مانده‌های مبتنی بر آمید، واسطه‌های رابط آبدوست و پیوند هیدروژنی جهت‌دار در توپولوژی‌های قطبی حل‌شونده، مانند Orb2 37، ایجاد می‌کنند، و سرین با وقفه در آرایش آب‌گریز در رابط‌های آبگریز55 در لایه‌های تنگ، هسته سه‌گانه را به پایان می‌رساند. (داده های توسعه یافته شکل 1c).

در DILT، جهت‌گیری مجدد این دو نقش متقابل، صفحه β KVKV و اتصال QINM، از طریق یک سرین مرکزی که به عنوان یک عنصر وارونه عمل می‌کند، به آرایش فضایی لازم از رابط‌های محوری و جانبی مکمل دست می‌یابد تا کاشی‌کاری سلسله مراتبی را با فیبریل‌های شش ضلعی دوباره سازمان‌دهی‌شده بدون تقارن پشتی-سازماندهی بزرگ و چرخه‌ای ایجاد کند. داربست

این آرایش مدولار رشد ذاتا یک بعدی صفحات β را به یک معماری سه بعدی (3D) تعریف شده با تقارن تبدیل می کند: جفت شدن متقاطع بتا باعث رشد فیبریل می شود، در حالی که اتصال trimeric رشته های همسایه را در زوایای مشخص قرار می دهد، و یک متقارن شش ضلعی ایجاد می کند که در امتداد منافذ شش ضلعی ایجاد می شود. ). پیوند متقاطع β دایمر و تریمریک با هم هندسه شش ضلعی یک نانوکانال فیبریلار پیوسته را تعریف می کنند.

سپس جهش های محافظه کارانه و غیر محافظه کارانه برای برهم زدن توزیع بار، بسته بندی آبگریز و هندسه اتصال در حالی که چارچوب کلی مدولار را حفظ می کنند (شکل 1a و داده های توسعه یافته شکل 1d) مورد استفاده قرار گرفتند، که عناصر هندسه کدگذاری شده را که برای تشکیل شبکه شش ضلعی مورد نیاز است برجسته می کند.

Cryo-EM هندسه برهمکنش کدگذاری شده را به صورت یک شبکه شش ضلعی ورقه β حاوی یک نانوکانال مرکزی پیوسته حل می کند. DILT1 فیبرهای بسیار منظمی را تشکیل می دهد که دو هم شکل ساختاری اصلی را می پذیرند: یک معماری شش ضلعی تک کانال (1-1-1؛ 12٪ فراوانی نسبی) و یک شبکه لانه زنبوری منبسط شده جانبی (3-3-3؛ 73٪ فراوانی نسبی) (شکل 2a و داده های توسعه یافته 2a). نماد سه رقمی تعداد منافذ شش ضلعی در هر یک از سه بخش شبکه قابل مشاهده در سطح مقطع را نشان می دهد.

بازسازی مارپیچی ساختارهای 1-1-1 و 3-3-3 را به ترتیب به 4.0 Å و 2.9 Å حل کرد و یک واحد تکراری متشکل از 12 زنجیره پپتیدی را نشان داد که به صورت 6 دایمر متقابل بتا در اطراف یک حفره مرکزی قرار گرفته اند (شکل 2b-end-e). در صفحه عمود بر محور فیبریل، این واحد تقارن C6 را نشان می دهد و یک حفره مرکزی تقریبا 5 نانومتری را در بر می گیرد که به طور مداوم در امتداد فیبریل منتشر می شود. بنابراین لایه های متوالی هندسه منافذ را در امتداد محور فیبریل حفظ می کنند و یک کانال شش ضلعی پیوسته را تعریف می کنند.

در مورفولوژی تک کانالی (1-1-1)، چگالی محیطی دایمرهای مجاور را از طریق ویژگی های مثلثی نیمه حل شده مطابق با اتصالات trimeric پیش بینی شده به هم متصل می کند. در معماری لانه زنبوری غالب، این اتصالات به طور کامل حل می شوند و واسطه تقارن و رشد جانبی در محیط شبکه هستند (زنجیره I-VI، شکل 2b). این کاشی کاری جانبی 7 شش ضلعی در هر لایه و در مجموع 60 زنجیره پپتیدی در یک مقطع منفرد ایجاد می کند.

یک میکروگراف Cryo-EM از DILT1 که مورفولوژی فیبریل های تک کانالی (1-1-1) و لانه زنبوری غالب (3-3-3) را با یک الگوی راه راه مشخص و متناوب نشان می دهد. ب، برش‌های مقطعی بازسازی‌شده DILT1 که شش دایمر متقاطع بتا رو به رو را نشان می‌دهد که در اطراف یک حفره مرکزی با تقارن C6 و شش زنجیره تشکیل‌دهنده اتصال (I-VI) مرتب شده‌اند. ج، نقشه چگالی فیبریل لانه زنبوری DILT1 3-3-3 که روی هم انباشته رشته β 4.77 Å در امتداد محور فیبریل را برجسته می کند.

d، برش های دو بعدی متوالی از طریق چگالی الکترون بازسازی DILT1 3-3-3 که جهت زنجیره و تقارن شبکه را نشان می دهد. e، مدل اتمی معماری DILT1 3-3-3 با 60 زنجیره پپتیدی در هر مقطع. درونی ها: متقاطع β-دایمر (مستطیل ها) و رابط های پیوند تریمریک (مثلث) که واسطه انتشار محوری و رشد جانبی هستند، از جمله نمای نزدیک از محل اتصال تریمریک که توسط سه زنجیره پپتیدی DILT1 تشکیل شده است. میله های مقیاس، 100 نانومتر (a)، 100 Å (b، d).

انباشته شدن پپتید محوری شفاف در 4.7-4.8 Å و چگالی الکترونی با وضوح بالا در بازسازی با وضوح بالاتر، مدل‌سازی اتمی شبکه کامل و تخصیص دایمر اصلی و رابط‌های اتصال را ممکن می‌سازد. مدل اتمی فیبریل 3-3-3 قطر 210 A، افزایش مارپیچ 4.77 Å و پیچش 0.64- درجه را ایجاد می کند. استفاده از تقارن C 6 واحد نامتقارن را به ده زنجیره منحصر به فرد در هر لایه کاهش می دهد، که سه تای آنها مستقیما در چگالی ساخته شده و با تقارن برای ایجاد معماری کامل منتشر می شود (داده های توسعه یافته شکل 2g).

نواحی پیرامونی چگالی الکترونی ضعیف‌تری را نشان می‌دهند، که نشان‌دهنده پویایی موضعی یا اتصالات ناقص است، که ویژگی‌های نیمه مثلثی مشاهده‌شده در مورفولوژی 1-1-1 را نشان می‌دهد. عدم وجود سومین زنجیره تشکیل‌دهنده اتصال نشان‌دهنده چگالی ناکافی تعریف‌شده cryo-EM برای مدل‌سازی توالی آن است، اگرچه چگالی باقی‌مانده با حضور آن سازگار است. بنابراین، مورفولوژی‌های 1-1-1 و 3-3-3 نشان‌دهنده ایزومورف‌های یک هندسه شبکه زیرین هستند که به جای حالت‌های مونتاژ مجزا، در میزان انبساط جانبی متفاوت هستند.

پیچش مارپیچی با قطر فیبریل کاهش می‌یابد: فیبریل‌های حاوی شش ضلعی بیشتر فواصل متقاطع بزرگ‌تر و زوایای پیچش کوچک‌تر را نشان می‌دهند (داده‌های توسعه یافته شکل 2b).

برای تعریف شبکه تعامل مرتبط با شبکه شش ضلعی، شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی را بر اساس ساختار cryo-EM معماری DILT1 3-3-3 انجام دادیم. مسیرها مجموعه ای مشترک و محدود از تعاملات آبگریز و پیوند هیدروژنی را نشان می دهند که انتشار محوری را به اتصال جانبی مرتبط می کند و در نتیجه هندسه شبکه را در مقیاس زمانی شبیه سازی شده در محلول بافر آبی حفظ می کند (شکل 3a).

در داخل کراس-β-دایمر، زنجیره‌های پرشده رو به رو با بسته‌بندی آبگریز زنجیره‌های جانبی V2 و V4 تثبیت می‌شوند (رابط d؛ شکل 3b و داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a)، که رابط رشد جانبی را تعریف می‌کند. این بسته بندی توسط پیوندهای هیدروژنی بین زنجیره ای مکرر تقویت می شود. در صفحه فیبریل، پیوندهای هیدروژنی بین Q6 و آمین ترمینال N (d(N)-lock) و برهمکنش های قطبی بین N8 و K1 (d(K1) قفل) تثبیت جهتی اضافی از رجیستری جانبی را فراهم می کند.

در محل اتصال، سه زنجیره پپتیدی یک هاب مثلثی فشرده را تشکیل می‌دهند که در آن بقایای I7 و M9 یک هسته آبگریز متراکم را ایجاد می‌کنند (رابط j؛ شکل 3b و داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a)، که از نظر توپولوژیکی معادل یک تعامل فضایی-زیپ سه برابری است. فعل و انفعالات جذاب دائمی بین پایانه M9 C و زنجیره های جانبی K3 و S5 یک زنجیره همسایه (j-lock؛ شکل 3b و داده های توسعه یافته شکل 3b)، از جمله پیوند هیدروژنی و تماس های الکترواستاتیک، این اتصال را بیشتر تثبیت می کند.

در امتداد محور فیبریل، پیوند هیدروژنی ستون فقرات در معماری متقاطع β، انباشته شدن دوره‌ای از لایه‌های شش ضلعی را به یک فیبریل نانوکانالی توسعه یافته هدایت می‌کند (شکل 3c و داده‌های توسعه‌یافته شکل 3c).

a، نانوکانال با شبکه شش ضلعی که توسط دایمرهای متقاطع بتا به صورت رو به رو تشکیل شده است که از طریق اتصالات تریمری از طریق سایت های انتشار جانبی متصل شده اند. باقیمانده‌های آمفی‌فیل توالی DILT1 خطی بر روی رابط‌های قطبی، پوشش منافذ و آبگریز نقشه‌برداری می‌کنند و یک نانوکانال تقریبا ۵ نانومتری در شبکه فیبریل ایجاد می‌کنند. ب، موتیف های تعامل مکمل و تعاملات قفل کننده نماینده. رابط d بین دایمرهای متقابل بتا واسطه بسته بندی آبگریز برای انتشار فیبریل های جانبی است.

رابط j، یک اتصال trimeric، دایمرهای همسایه را به هم متصل می کند که اتصال جانبی را برای تشکیل شبکه شش ضلعی رمزگذاری می کند. d-locks رجیستری جانبی را از طریق فعل و انفعالات بین رشته ای قطبی، از جمله پیوند هیدروژنی بین Q6 و N-پایانه (d(N)-lock) و برهمکنش های مربوط به K1، N8 و Q6 (d(K1)-lock) تثبیت می کند. فعل و انفعالات j-lock رابط اتصال را در نوک آن توسط پیوندهای هیدروژنی جهت دار و برهمکنش های الکترواستاتیکی شامل S5، K3 و C-پایانه تثبیت می کند.

ج، انباشته شدن محوری پپتیدهای DILT، شبکه را در امتداد محور فیبریل از طریق پیوندهای هیدروژنی ستون فقرات پپتیدی منتشر می کند. د، خلاصه سلسله مراتب تعامل. رابط های j (مثلث های قرمز) اتصال جانبی و تقارن شش برابری را فراهم می کنند، رابط های d (مستطیل های قرمز) واسطه انباشته شدن ورق β و ارتباط جانبی هستند، و قفل های j (کره های خاکستری) انسجام اتصال را تقویت می کنند و با هم از یک معماری نانو کانال شش ضلعی پشتیبانی می کنند.

شبیه‌سازی‌های یک فیبریل 94 لایه (طول 44.8 نانومتر؛ پیچش کل 60.16 درجه) هندسه شبکه تجربی را بیش از 100 ns حفظ کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3d). تجزیه و تحلیل نوسانات ریشه میانگین مربع (RMSF) میانگین نوسانات ستون فقرات زیر 2.5 Å را نشان داد که از یکپارچگی ساختاری مدل در این مقیاس زمانی پشتیبانی می کند (داده های توسعه یافته شکل 3e,f). در مقابل، دایمرهای متقابل بتا جدا شده و مجموعه‌های شش ضلعی آن‌ها فاقد اتصالات به سرعت بی‌ثبات می‌شوند، در حالی که نقوش اتصال ایزوله و نانوکانال‌های شش ضلعی در مقیاس زمانی شبیه‌سازی شده دست نخورده باقی می‌مانند (شکل داده‌های توسعه‌یافته، شکل.

3g,h)، از مدلی پشتیبانی می کند که در آن محل اتصال، انسجام جانبی اصلی مورد نیاز برای تشکیل کانال شش ضلعی را فراهم می کند. پایداری افزایش یافته اتصال با کمک های هر دو رابط j آبگریز فشرده و سه برهمکنش j قفل کننده سازگار است که با هم انسجام جانبی را از طریق بسته بندی ترکیبی و تماس های پیوند هیدروژنی تقویت می کنند. نقشه برداری از این فعل و انفعالات بر روی سطح مقطع فیبریل، پارتیشن بندی آمفیفیلیک برجسته را نشان می دهد، با هسته های آبگریز مدفون و سطوح آب دوست که منافذ را پوشانده اند.

این سازمان با یک نانوکانال قابل دسترسی به حلال سازگار است که در آن باقیمانده‌های قطبی در معرض حلال، محیط کانال را تعریف می‌کنند، در حالی که رابط‌های آبگریز شبکه را تثبیت می‌کنند. بنابراین، انتشار محوری، تشکیل اتصال جانبی، فعل و انفعالات قفلی و پیوند هیدروژنی ستون فقرات، یک سلسله‌مراتب برهمکنش جفت شده را تشکیل می‌دهند که از معماری متقارن شش برابری قابل گسترش محوری و جانبی در محلول آبی پشتیبانی می‌کند.

برای آزمایش اینکه آیا توپولوژی شبکه در دنباله پپتیدی کدگذاری شده است یا خیر، ما ساختار انواع آرژنین DILT2 (RVKVSQINM) و DILT3 (KVRVSQINM) را با استفاده از cryo-EM تعیین کردیم. هر دو در ساختارهای نانو کانال شش ضلعی با هندسه حفره های حفظ شده و اتصال اتصال جمع می شوند، که نشان می دهد سازمان شبکه در سراسر این گونه های توالی حفظ شده است (شکل 4a). DILT2 عمدتا یک ایزومورفولوژی 4-4-4 (تقریبا 80٪) با جمعیت های جزئی 2-2-2 و 1-1-1 (تقریبا 10٪ هر کدام) را تشکیل می دهد.

دو ایزومورفولوژی اول (4-4-4 و 2-2-2) به ترتیب با وضوح 1.9 و 3.4 Å بازسازی شدند (شکل 4b و داده های توسعه یافته شکل 4a,b). افزایش و پیچش مارپیچ به ترتیب 4.781 Å و -0.409 درجه و 4.812 Å و -8.2 درجه تعیین شد. مرکز تقارن به برابری آرایش شش ضلعی بستگی دارد.

برای آرایش های شش ضلعی با اعداد فرد (مثلا 3-3-3)، محور تقارن در مرکز حفره مرکزی قرار دارد و تقارن C6 را ایجاد می کند، در حالی که برای مورفولوژی های زوج (مثلا 4-4-4)، مرکز تقارن در محل اتصال مرکزی، تقارن C3 قرار دارد. DILT3 عمدتا مورفولوژی 3-3-3 (تقریبا 70٪) را اتخاذ می کند و در وضوح 1.78 A، با افزایش مارپیچ 4.791 Å و پیچش 0.6115- درجه حل شد. در این وضوح، ترکیبات زنجیره جانبی در هر دو دایمر متقاطع و اتصالات به طور مستقیم مشاهده می شود.

a، ماتریس مقطع DILT. برش های فیبریل شبیه سازی شده و بازسازی شده که انبساط جانبی را با افزودن عدد صحیح واحدهای شش ضلعی نشان می دهد. b، نقشه‌های چگالی Cryo-EM و مدل‌های اتمی DILT2 (RVKVSQINM) و DILT3 (KVRVSQINM) که اتصال پیوند سه‌گانه حفظ شده و قطر حفره تقریبا 5 نانومتری را نشان می‌دهند. اینست ها: موتیف اتصال سه زنجیره ای. ج، پیش‌بینی‌های شبیه‌سازی‌شده به‌دست‌آمده از مدل اتمی، الگوی نوار متناوب مشخصه مشاهده‌شده در میکروگراف‌های cryo-EM DILT1 را بازتولید می‌کنند و از هندسه شبکه مشترک پشتیبانی می‌کنند.

d، میکروگراف‌های Cryo-EM از DILT4 (GVKVSQINM) و DILT5 (YVKVSQINM) و همچنین نماهای بزرگ‌نمایی شده مربوطه، الگوهای نواری مشابه DILT1 (KVKVSQINM) را نشان می‌دهند که نشان‌دهنده حفظ معماری نانوکانال شش ضلعی با وجود توالی است. تعداد نوارها با تعداد شش ضلعی های متصل جانبی (به عنوان مثال، 3-3-3 یا 2-2-2 ایزومورف) همبستگی دارد. میله های مقیاس، 100 Å (a)، 100 نانومتر (c، d).

در تمام انواع، شبکه شش ضلعی، اتصال trimeric و نانوکانال تقریبا 5 نانومتری ثابت می‌مانند (شکل 4b و داده‌های توسعه‌یافته شکل 4c)، که نشان می‌دهد توپولوژی جهانی از هندسه برهمکنش کدگذاری شده پدیدار می‌شود. بنابراین، اغتشاشات توالی در این موارد، بسته بندی محلی را بدون تغییر تقارن اساسی یا معماری منافذ تعدیل می کند.