طراحی جدید سیستئین پروتئازها

علیرغم پیشرفت‌هایی که در طراحی آنزیم‌های جدید صورت گرفته، موفقیت تا حد زیادی به واکنش‌های مدل سد انرژی کم محدود شده است. پیوندهای آمیدی مانند پیوندهایی که اسیدهای آمینه را در امتداد ستون فقرات پپتیدی به هم پیوند می‌دهند به دلیل سد انرژی بالا در برابر هیدرولیز برای صدها سال در محلول آبی خنثی پایدار هستند. در اینجا ما طراحی جدید آنزیم‌هایی را توصیف می‌کنیم که از یک نوکلئوفیل سیستئین فعال برای هیدرولیز ستون فقرات پلی پپتیدی به روشی وابسته به توالی، با نرخ موفقیت 13/69 = 19٪ و افزایش سرعت نسبت به واکنش پس‌زمینه (k cat / k uncat) تا 3 × 10 7 استفاده می‌کنند.

پروتئازهای طراحی شده دارای چین‌هایی هستند که بسیار متفاوت از پروتئازها در طبیعت هستند (امتیاز TM <0.50)، و شش ساختار کریستالی بسیار نزدیک به مدل‌های طراحی هستند (میانگین مربع انحراف ریشه Ca کمتر از 1.2 Å)، که ظرفیت تعمیم و دقت روش طراحی را برجسته می‌کند. تحلیل‌های تجربی و محاسباتی نشان می‌دهند که شکاف باقی‌مانده در فعالیت نسبت به فعال‌ترین پروتئازهای سیستئین بومی ناشی از نقص در سازمان‌دهی پیش‌سازمان‌دهی محل فعال و موقعیت‌یابی بستر است.

پروتئازهای طراحی شده به طور موثر اهداف خود را در سلول های پستانداران می شکافند و در را به روی طیف گسترده ای از کاربردهای زیست شناسی مصنوعی باز می کنند.

این یک پیش نمایش از محتوای اشتراک است، دسترسی از طریق موسسه شما

به Nature و 54 مجله Nature Portfolio دیگر دسترسی داشته باشید

Nature+ را دریافت کنید، بهترین اشتراک دسترسی آنلاین ما

قیمت‌ها ممکن است مشمول مالیات‌های محلی باشد که در هنگام تسویه حساب محاسبه می‌شود

مختصات اتمی و فاکتورهای ساختاری تولید شده در این مطالعه از طریق بانک داده پروتئین RCSB تحت کدهای الحاقی 9YNL، 9YNM، 9YOX، 9YOY، 9YOZ و 9YP0 به صورت عمومی در دسترس هستند. منبع داده های زیر شکل. 1 - 5 و داده های توسعه یافته شکل. 1 تا 10 با این مقاله ارائه شده است. ساختارهای در دسترس عموم که به عنوان ورودی محاسباتی یا مراجع ساختاری استفاده می‌شوند از بانک داده‌های پروتئین RCSB تحت کدهای الحاقی 1EUV، 1TL9، 1ATK، 8A4V، 1NQC، 1ME3، 3BPF، 1BP4، 1PPNVZ و

توالی های پروتئین در جدول تکمیلی 1 ارائه شده اند و توالی DNA کامل پلاسمید در اطلاعات تکمیلی 1 و 2 ارائه شده است.

کد مورد استفاده برای طراحی و تحلیل محاسباتی در GitHub (https://github.com/hojaec/RFD2_MI_cysteine_protease_pipeline) در دسترس عموم است. کد مورد استفاده برای داده‌های جنبشی بیوشیمیایی و تجزیه و تحلیل تصاویر سلول پستانداران در GitHub (https://github.com/hojaec/Cysteine-protease-data-analysis) در دسترس عموم است.

Radzicka، A. و Wolfenden، R. نرخ هیدرولیز پیوند پپتیدی کاتالیز نشده در محلول خنثی و تمایلات حالت گذار پروتئازها. J. Am. شیمی. Soc. 118، 6105-6109 (1996).

Dyer, R. P. & Weiss, G. A. ساخت برش با مهندسی پروتئاز. سلول شیمی. Biol. 29، 177-190 (2022).

اتو، اچ.-اچ. & Schirmeister، T. سیستئین پروتئازها و مهارکننده های آنها. شیمی. Rev. 97, 133-172 (1997).

Carter, P. & Wells, J. A. تشریح سه گانه کاتالیزوری یک پروتئاز سرین. Nature 332, 564-568 (1988.

منارد، آر و همکاران. تغییر محیط الکترواستاتیک در سوراخ اکسانیون سیستئین پروتئاز پاپائین قابل تحمل است. Biochemistry 34، 464-471 (1995).

پروتئازهای ورما، اس.، دیکسیت، آر. جلو. فارماکول. 7, 107 (2016).

Lauko، A. و همکاران. طراحی محاسباتی هیدرولازهای سرین Science 388, eadu2454 (2025).

مقاله CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

کیم، دی و همکاران طراحی محاسباتی متالوهیدرولازها Nature 649، 246-253 (2026).

Ahern، W. و همکاران. داربست سایت فعال آنزیم سطح اتمی با استفاده از RFdiffusion2. نات. روش‌های 23، 96-105 (2026).

بائر، ام اس و همکاران. طراحی جدید بایندرهای پپتیدی فسفو تیروزین. پیش چاپ در bioRxiv https://doi.org/10.1101/2025.09.29.678898 (2025).

Mossessova، E. & Lima، C. D. ساختار کریستالی Ulp1-SUMO و تجزیه و تحلیل ژنتیکی، برهمکنش های حفاظت شده و یک عنصر تنظیمی ضروری برای رشد سلولی در مخمر را نشان می دهد. مول. سلول 5، 865-876 (2000).

داپاراس، جی و همکاران. طراحی توالی پروتئین مبتنی بر یادگیری عمیق با استفاده از ProteinMPNN. Science 378، 49-56 (2022).

مقاله ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

آبرامسون، جی و همکاران. پیش‌بینی ساختار دقیق برهم‌کنش‌های بیومولکولی با AlphaFold 3. Nature 630، 493-500 (2024).

بیندلز، دی اس و همکاران. mScarlet: یک پروتئین فلورسنت قرمز مونومر روشن برای تصویربرداری سلولی. نات. روش 14، 53-56 (2017).

ماتایوشی، ای. Science 247, 954-958 (1990).

Hofer, F., Kraml, J., Kahler, U., Kamenik, A. S. & Liedl, K. R. سایت کاتالیستی مقادیر pKa پروتئازهای آسپارتیک، سیستئین و سرین: شبیه سازی pH ثابت MD. جی. شیمی. Inf. مدل. 60، 3030–3042 (2020).

Zhai، X. & Meek، T. D. مکانیسم کاتالیزوری کروزاین از Trypanosoma cruzi همانطور که از اثرات ایزوتوپ جنبشی حلال سینتیک های حالت پایدار و پیش-پایا تعیین شد. Biochemistry 57، 3176-3190 (2018).

Daniel, R. M. & Danson, M. J. درک جدیدی از چگونگی تأثیر دما بر فعالیت کاتالیزوری آنزیم ها. Trends Biochem. Sci 35, 584-591 (2010).

Xu، Z. و همکاران. اساس مولکولی تنظیم ردوکس پروتئازهای SUMO: مکانیزم محافظتی از پیوند دی سولفید بین مولکولی در برابر اکسیداسیون سولفیدریل برگشت ناپذیر. FASEB J. 22, 127-137 (2008).

ون کمپن، ام و همکاران. جستجوی سریع و دقیق ساختار پروتئین با Foldseek. نات. بیوتکنول. 42، 243-246 (2024).

Zhang, Y. & Skolnick, J. عملکرد امتیازدهی برای ارزیابی خودکار کیفیت الگوی ساختار پروتئین. Proteins 57, 702-710 (2004).

Anishchenko، I. و همکاران. مدل‌سازی مجموعه‌های ساختاری پروتئین-مولکول کوچک با PLACER. Proc. Natl Acad. علمی USA 122, e2427161122 (2025).

LaLonde، J. M. و همکاران. استفاده از پاپائین به‌عنوان مدلی برای طراحی مبتنی بر ساختار مهارکننده‌های کاتپسین K: ساختارهای کریستالی دو کمپلکس بازدارنده پاپاین، اتصال به S'-زیر سایت‌ها را نشان می‌دهند. جی. مد. شیمی. 41، 4567-4576 (1998).

Tsuge، H. و همکاران. مکانیسم مهار مهارکننده های اختصاصی کاتپسین L بر اساس ساختار کریستالی کمپلکس papain-CLIK148. بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 266، 411-416 (1999).

Mldoveanu، T.، Campbell، R. L.، Cuerrier، D. & Davies، P. L. ساختارهای کریستالی کمپلکس‌های بازدارنده calpain-E64 و -leupeptin حلقه‌های متحرکی را نشان می‌دهند که محل فعال را باز می‌کنند. جی. مول. Biol. 343، 1313-1326 (2004).

فالک، اس و همکاران. توضیح ساختاری و فعالیت ضد ویروسی مهارکننده‌های کاتپسین L کووالانسی جی. مد. شیمی. 67، 7048-7067 (2024).

یاماموتو، A. و همکاران. اساس ساختاری برای توسعه مهارکننده نوع غیرکووالانسی اختصاصی کاتپسین B: ساختار کریستالی کمپلکس کاتپسین B-E64c. بیوشیم. بیوفیز. Acta 1597، 244-251 (2002).

پائولی، تی ای و همکاران تعیین‌کننده‌های اختصاصی کاتپسین‌های انسانی که توسط ساختارهای کریستالی کمپلکس‌ها نشان داده شد. Biochemistry 42، 3203-3213 (2003).

Huang, L., Brinen, L. S. & Ellman, J. A. ساختارهای کریستالی مهارکننده های برگشت پذیر مبتنی بر کتون سیستئین پروتئاز کروزاین. Bioorg. پزشکی شیمی. 11، 21-29 (2003).

کاپوست، آر بی و همکاران. پروتئاز ویروس اچ توتون: مکانیسم اتولیز و طراحی منطقی جهش یافته های پایدار با مهارت کاتالیزوری نوع وحشی مهندس پروتئین 14، 993-1000 (2001).

Kenneson، J. R. و همکاران. بررسی انواع مقاوم به داروی احتمالی پروتئاز اصلی SARS-CoV-2 (Mpro) با نامزد پیش بالینی غیرکووالانسی، Mpro61. ACS Bio Med Chem Au 5, 215–226 (2025).

می، ام و همکاران. یک استراتژی ترکیبی برای مهندسی پروتئاز HRV 3C برای دستیابی به برش آزاد ترمینال N. بین المللی جی بیول. ماکرومول. 265 , 131066 (2024).

پرلمن، D. A. و همکاران. AMBER، بسته ای از برنامه های کامپیوتری برای به کارگیری مکانیک مولکولی، تحلیل حالت عادی، دینامیک مولکولی و محاسبات انرژی آزاد برای شبیه سازی خواص ساختاری و انرژی مولکول ها. محاسبه کنید. فیزیک اشتراک. 91، 1-41 (1995).

Shaffer، J. M. & Greenwald، I. SALSA، یک حسگر زیستی رمزگذاری شده ژنتیکی برای تعیین کمیت مکانی و زمانی انتقال سیگنال Notch در داخل بدن. توسعه دهنده سلول 57، 930-944.e6 (2022).

Gao, X. J., Chong, L. S., Kim, M. S. & Elowitz, M. B. مدارهای پروتئینی قابل برنامه ریزی در سلولهای زنده. Science 361, 1252-1258 (2018).

رویبال، K. T. و همکاران. مهندسی سلول های T با برنامه های پاسخ درمانی سفارشی با استفاده از گیرنده های Notch مصنوعی. سلول 167، 419-432 (2016).

بارنیا، جی و همکاران. طراحی ژنتیکی آبشارهای سیگنالینگ برای ثبت فعال شدن گیرنده Proc. Natl Acad. علمی USA 105، 64-69 (2008).

کوکوس، آر و همکاران. یک گزارش‌گر رونویسی مهندسی شده محلی‌سازی پروتئین، تنظیم‌کننده‌های قاچاق پروتئین غشایی میتوکندری و ER را در صفحه‌های CRISPRi با کارایی بالا شناسایی می‌کند. eLife 10، e69142 (2021).

Novinec، M. & Lenarčič، B. پپتیدازهای مشابه پاپاین: ساختار، عملکرد و تکامل. Biomol. مفاهیم 4، 287-308 (2013).

Hekkelman، M. L.، Salmoral، D. Á، Perrakis، A. & Joosten، R. P. DSSP 4: حاشیه نویسی عادلانه ساختار ثانویه پروتئین. پروتئین Sci. 34, e70208 (2025).

بنت، N. R. و همکاران. بهبود طراحی بایندر پروتئین de novo با یادگیری عمیق. نات. اشتراک. 14, 2625 (2023).

Kuo، C.-J.، Chi، Y.-H.، Hsu، J. T.-A. و لیانگ، P.-H. شناسایی پروتئاز اصلی SARS و سنجش مهارکننده با استفاده از یک بستر فلوروژنیک بیوشیمی. بیوفیز. Res. اشتراک. 318، 862-867 (2004).

Kabsch, W. ادغام، مقیاس‌بندی، تخصیص فضا-گروه و پس از اصلاح. Acta Crystallogr. D 66، 133-144 (2010).

Winn، M. D. و همکاران. مروری بر مجموعه CCP4 و تحولات فعلی. Acta Crystallogr. D 67, 235-242 (2011).

مک کوی، A. J. و همکاران. نرم افزار کریستالوگرافی فازر. J. Appl. کریستالوگر. 40، 658-674 (2007).

آدامز، پی دی و همکاران. PHENIX: یک سیستم جامع مبتنی بر پایتون برای حل ساختار ماکرومولکولی. در جداول بین المللی برای کریستالوگرافی 539-547 (اتحادیه بین المللی کریستالوگرافی، 2012).

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: ابزارهای مدل سازی برای گرافیک مولکولی. Acta Crystallogr. D 60, 2126-2132 (2004).

ویلیامز، سی جی و همکاران. MolProbity: داده های مرجع بیشتر و بهتر برای اعتبار سنجی ساختار تمام اتمی بهبود یافته است. پروتئین Sci. 27، 293-315 (2018).

جمع‌آوری داده‌های کریستالوگرافی بر روی خط پرتو APS NE-CAT 24ID-E و جایزه (های) زمان پرتو (https://doi.org/10.46936/APS-189869/60014006) از منبع فوتون پیشرفته، یک اداره ملی انرژی ایالات متحده (DOE) اداره ملی علوم برای کاربر LaDOE توسط fac. قرارداد شماره DE-AC02-06CH11357.

این تحقیق از منابع (FMX/AMX) منبع نور ملی سنکروترون II، یک مرکز کاربر علوم دفتر علوم وزارت انرژی ایالات متحده (DOE) که برای دفتر علوم DOE توسط آزمایشگاه ملی بروکهاون تحت قرارداد شماره‌ای اداره می‌شود، استفاده کرد. DE- SC0012704. مرکز ساختار بیومولکولی (CBMS) اساسا توسط مؤسسه ملی بهداشت، مؤسسه ملی علوم پزشکی عمومی (NIGMS) از طریق کمک مالی مرکز هسته P30 (P30GM133893) و توسط دفتر تحقیقات بیولوژیکی و محیطی DOE (KP1607011) پشتیبانی می شود.

داده‌های کریستالوگرافی در NSLS II تحت پیشنهاد NECAT BAG 317877 یا WestCoastBAG2026 جمع‌آوری شد. شماتیک ها در شکل 5 با استفاده از BioRender ایجاد شده اند.

این کار توسط افراد زیر تامین مالی شد: بنیاد بیل و ملیندا گیتس INV-043758; اعطای آژانس کاهش تهدیدات دفاعی HDTRA1-19-1-0003; موسسه پزشکی هوارد هیوز؛ پروژه جسورانه در موسسه طراحی پروتئین؛ و پروژه بشردوستانه باز بهبود صندوق طراحی پروتئین. این مطالب بر اساس کار پشتیبانی شده توسط بنیاد ملی علوم با شماره کمک مالی است. CHE-2226466. این تحقیق توسط موسسه ملی آلرژی و بیماری‌های عفونی مؤسسه ملی بهداشت، کمک هزینه R01AI160052 پشتیبانی شده است.

این تحقیق توسط مؤسسه ملی سالمندی مؤسسه ملی بهداشت، کمک مالی R01AG063845 پشتیبانی شده است. این کار توسط آژانس پروژه های تحقیقاتی پیشرفته برای سلامتی APECx جایزه برنامه شماره 1AY1AX000036 پشتیبانی شد. کمک مالی بنیاد گیتس INV-043758؛ بنیاد حفاظت از محیط زیست گرانتام؛ و بنیاد خانواده اشمیت،

گروه بیوشیمی، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

Hojae Choi، Magnus S. Bauer، Brian Coventry، Preetham Venkatesh، Anqi Chen، Donghyo Kim، Asim K. Bera، Alex Kang، Hannah Nguyen، Shayan Sadre، Justin Decarreau، Emily Joyce، Toscan Rock Thompson، Jacob Merle Gershon، Samuel J.

موسسه طراحی پروتئین، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

Hojae Choi، Magnus S. Bauer، Brian Coventry، Preetham Venkatesh، Anqi Chen، Donghyo Kim، Asim K. Bera، Alex Kang، Hannah Nguyen، Shayan Sadre، Justin Decarreau، Emily Joyce، Toscan Rock Thompson، Gabriel Greenstein، Jaco J. Merledi. پلاک و دیوید بیکر

برنامه تحصیلات تکمیلی در فیزیک بیولوژیکی، ساختار و طراحی، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

Hojae Choi، Preetham Venkatesh و Toscan Rock Thompson

موسسه پزشکی هوارد هیوز، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

برنامه زیست شناسی مولکولی و سلولی، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

بیوفیزیک مولکولی و بیو تصویربرداری یکپارچه، آزمایشگاه ملی لارنس برکلی، برکلی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا

گروه علوم و مهندسی مواد، دانشگاه استنفورد، استانفورد، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا

گروه علوم کامپیوتر، دانشگاه آکسفورد، آکسفورد، انگلستان

آزمایشگاه کاوندیش، گروه فیزیک، دانشگاه کمبریج، کمبریج، انگلستان

گروه مواد، امپریال کالج لندن، لندن، بریتانیا

گروه مهندسی مولکولی، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

برنامه آموزش دانشمندان پزشکی، دانشگاه واشنگتن، سیاتل، WA، ایالات متحده آمریکا

گروه علوم زیستی، مؤسسه علوم و فناوری پیشرفته کره، Daejeon، جمهوری کره

آزمایشگاه شیمی آلی، ETH زوریخ، زوریخ، سوئیس

H.C. و S.J.P. خط لوله طراحی محاسباتی را با مشارکت P.V. قبل از میلاد مسیح و M.S.B. مدل RFD2-MI را توسعه داد. H.C. پروتئازها را طراحی و مشخص کرد. S.S. و J.D. در آزمایشات سلولی پستانداران مشارکت داشتند. G.G.، K.D.، L.L.S. و G.R.L. به تجزیه و تحلیل محاسباتی کمک کرد. A.K.B.، A.K.، H.N.، E.J.، B.S. و S.J.P. ساختارهای کریستالی را تعیین و تجزیه و تحلیل کرد. D.H.، S.J.P. و D.B. بر تحقیق نظارت داشت. H.C.، D.H.، S.J.P. و D.B. دست نوشته را نوشت. M.S.B.، A.C.، D.K.، T.R.T.، J.M.G. و A.F.S. به نسخه خطی کمک کرد.

همه نویسندگان مقاله را بررسی و نظر دادند.

مکاتبه با دونالد هیلورت، ساموئل جی. پلاک یا دیوید بیکر.

Nature از جیمز فریزر و دیگر منتقدان ناشناس برای مشارکت در بررسی همتایان این اثر تشکر می‌کند. گزارش های بازبین همتا در دسترس است.

یادداشت ناشر Springer Nature با توجه به ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های سازمانی بی طرف باقی می ماند.

الف، مکانیسم سیستئین پروتئاز. b، مروری بر خط لوله محاسباتی: چرخه تکرار شونده (RFD2-MI → ProteinMPNN → AF3)، با تعداد طرح های حفظ شده در هر مرحله. c، نمونه ای از فایل محدودیت استفاده شده در Rosetta FastRelax برای حفظ هندسه کاتالیزوری در طول بهینه سازی توالی.

تجزیه و تحلیل SDS-PAGE 69 طرح پس از تصفیه IMAC. هر نمونه در دو شرایط جوشانده و جوشانده اجرا شد. خطوط نقطه چین مناطق مربوط به هر گروه ستون فقرات را نشان می دهد. کنترل مثبت (TEV WT) با رنگ آبی، کنترل منفی (TEV C151A) به رنگ نارنجی، و طرح هایی که فعالیت برش ("ضربه ها") را به رنگ قرمز نشان می دهند برجسته شده است. نمونه‌ها در همان آزمایش روی ژل‌هایی که به‌طور موازی پردازش شده‌اند، آنالیز شدند. آزمایش به طور مستقل 3 بار با نتایج مشابه تکرار شد. b، تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی اندازه-محروم (SEC) از 69 طرح پس از خالص سازی IMAC.

خط نقطه قرمز حجم شستشوی مورد انتظار محصول شکافته شده (mScarlet رایگان) را نشان می دهد. کنترل مثبت (TEV WT) در جعبه آبی، کنترل منفی (TEV C151A) در جعبه نارنجی، و طرح هایی که فعالیت برش ("ضربه ها") را در جعبه های قرمز نشان می دهند نشان داده شده است.

الف، کسری مربوط به محصول شکاف مورد انتظار از HPLC جمع آوری و توسط LC-MS تجزیه و تحلیل شد. در تمام موارد، طیف جرمی برش را در محل طراحی شده تایید کرد. ب , غربالگری همزمان با بیان طرح هایی که دارای ناک اوت باقی مانده های کاتالیزوری کلیدی هستند. جایگزینی سیستئین، هیستیدین، یا باقی مانده سوراخ اکسانیون (Asn/Gln) برای ارزیابی فعالیت برش درون مولکولی استفاده شد، که نقش اساسی آنها در کاتالیز را تایید می کند.

اندازه‌گیری‌های FRET برای هر طرح با بستر پپتیدی جفت‌شده با FRET. واکنش‌ها با آنزیم 10 میکرومولار و سوبسترای 200 میکرومولار در صفحه‌خوان فلورسانس انجام شد. a، hc04-10. b، hc32-38. ج، اندازه‌گیری LC-MS پس از نمونه‌های سنجش FRET (Dokki) که حاوی کل بستر، محصول 1، محصول 2 است.

یک گردش کار طراحی مجدد با هدایت pLDDT که در Dokki اعمال می شود. b، توزیع معیارهای پیش‌بینی AF3 برای انواع طراحی مجدد Dokki نشان داده شده است، از جمله پیش‌بینی‌های پیچیده (pLDDT، min PAE، pLDDT باقیمانده کلید، iPTM) و پیش‌بینی‌های apo (pLDDT، pTM، pLDDT باقیمانده کلید، RMSD تا پیش‌بینی پیچیده). خط قرمز نقطه چین مقادیر متریک AF3 Dokki WT را نشان می دهد. ج، واکنش های غربالگری با 10 میکرومولار آنزیم و بستر 100 میکرومولار با استفاده از صفحه خوان انجام شد (به روش ها مراجعه کنید). از 89 طراحی مجدد، 24 مورد از طراحی اصلی Dokki عملکرد بهتری داشتند، با بهبود نرخ از 1.2 تا 31 برابر.

سبز نشان‌دهنده WT، آبی نشان‌دهنده طرح‌های پیشرفته، و قرمز نشان‌دهنده بهبود یافته‌ترین نوع (Dokki-15) است. d، تجزیه و تحلیل جنبشی حالت پایدار برازش معادله Michaelis-Menten، ارائه k cat ظاهری، KM، و مقادیر بازده کاتالیزوری Dokki و Dokki-15. خطوط به ترتیب نشان دهنده میانگین و s.d از سه تکرار فنی (n = 3) هستند.

a، منحنی استاندارد برای تبدیل RFU به غلظت EDANS آزاد (50، 25، 12.5، 6.25 میکرومولار) (RFU = 311.56 × Conc.(μM)). خطوط به ترتیب نشان دهنده میانگین و s.d از سه تکرار فنی (n = 3) هستند. b، اندازه‌گیری‌های پلیت خوان محصولات برش کامل در غلظت آنزیم بالا (25 میکرومولار) و غلظت سوبسترا 50، 25، و 12.5 میکرومولار، به ترتیب با مقادیر RFU 14384، 6994 و 3661. خطوط و سایه‌زنی به ترتیب میانگین و sd را از سه تکرار فنی نشان می‌دهند (n = 3).

c، منحنی استاندارد برای تبدیل RFU به غلظت آزاد GGS–EDANS (50، 25، 12.5 میکرومولار) (RFU = 286.42× Conc.(μM)). خطوط به ترتیب نشان دهنده میانگین و s.d از سه تکرار فنی (n = 3) هستند. d، نمودارهای خطی برای Gawi-09 و e، نمودارهای خطی برای Dokki-15. خطوط و سایه‌زنی به ترتیب میانگین و sd را از سه تکرار فنی نشان می‌دهند (n = 3). f، نمودار خطی برای پروفیل های نرخ pH Dokki-15. خطوط و سایه‌زنی به ترتیب میانگین و sd را از سه تکرار فنی نشان می‌دهند (n = 3). g، نمودارهای خطی برای Dokki-15 به عنوان تابعی از دما.

خطوط و سایه‌زنی به ترتیب میانگین و sd را از سه تکرار فنی نشان می‌دهند (n = 3). ساعت، تعداد گردش کل (TTN) برای غلظت‌های مختلف سوبسترا (400، 200، 100، 50 میکرومولار) با آنزیم‌های 10 میکرومولار، که به ترتیب مربوط به حداکثر TTN‌های 40، 20، 10 و 5 است. خطوط و سایه‌زنی به ترتیب میانگین و sd را از سه تکرار فنی نشان می‌دهند (n = 3).

هم ترازی ساختاری ساختارهای کریستالی پروتئازهای طراحی شده با نزدیکترین تطابق آنها که توسط جستجوی Foldseek در برابر پایگاه داده PDB شناسایی شده است. برای هر طرح، ساختار آزمایشی تعیین شده با ضربه Foldseek با امتیاز بالا پوشانده می شود: a , Kal; b , Gawi-09; ج، داکی؛ d، Dokki-15. روکش ها شباهت تاهای جهانی را نشان می دهند. این مقایسه ها تایید می کند که داربست های طراحی شده از توپولوژی های پروتئینی طبیعی استفاده نمی کنند. e، پوشش ساختارهای کریستالی Ulp1 که حالت میانی پیچیده و حالت اکسیداسیون را مقایسه می کند.