مهاجرت جهانی ماقبل تاریخ میکروب های روده در حال محو شدن با انسان

میکروبیوم روده برای سلامتی حیاتی است و به شدت تحت تأثیر سبک زندگی قرار می گیرد. بسیاری از میکروارگانیسم هایی که معمولا در جمعیت های غیر صنعتی یافت می شوند در حال ناپدید شدن هستند یا در جمعیت های صنعتی منقرض شده اند 2، 3، 4، 5، 6. مطالعه اینکه کدام میکروارگانیسم‌ها ساکن طولانی‌مدت روده انسان بوده‌اند و احتمالا با انسان‌ها تکامل یافته‌اند (2، 7، 8) می‌تواند بینش‌هایی را در مورد اینکه چگونه از دست دادن تنوع زیستی میکروبی بر سلامت انسان تأثیر می‌گذارد، ارائه دهد.

با این حال، پیچیدگی های ژنتیکی تکامل میکروبی و شکل پذیری ترکیب میکروبیوم روده حل کردن تاریخچه تکاملی این ارتباطات طولانی مدت را چالش برانگیز کرده است. در اینجا ما توالی‌یابی متاژنومی عمیق باغداران Tsimane در بولیوی را انجام دادیم و میکروبیوم‌های روده آنها را با شکارچیان Hadza از تانزانیا مقایسه کردیم. این دو جمعیت، که اجدادشان ده ها هزار سال است از هم جدا شده اند، دارای 1231 گونه میکروبی هستند که اکثر آنها در جمعیت های صنعتی نادر هستند یا وجود ندارند.

تجزیه و تحلیل ژنتیکی جمعیت 636 گونه مشترک، الگوهای واگرایی میکروبی و جریان ژنی را نشان داد که با مهاجرت مشترک انسان ماقبل تاریخ مطابقت دارد، با زمان‌های تقسیم تخمینی که تقریبا با مهاجرت انسان به خارج از آفریقا و به آمریکا همخوانی دارد. یافته‌های ما نشان می‌دهد که یک میکروبیوم روده متنوع با انسان‌ها در سراسر جهان مهاجرت کرده و طی هزاران سال ادامه داشته است. با این حال، بسیاری از این گونه ها در حال حاضر از جمعیت های صنعتی ناپدید شده اند و عواقب آن برای سلامت انسان نامشخص است.

باکتری های روده مشترک نقش پیچیده ای در زیست شناسی انسان ایفا می کنند، اما تاریخچه تکاملی این روابط میکروبی به خوبی مشخص نشده است. شناسایی ارتباطات طولانی‌مدت بین انسان و میکروارگانیسم‌ها برای درک تکامل مشترک آنها مهم است 7، 10، 11، و این می‌تواند گونه‌های میکروبی و عملکردهای جدایی‌ناپذیر سلامت و فیزیولوژی انسان را آشکار کند.

مشاهدات مستقیم روابط میکروبی تاریخی با توالی یابی پالئوفاس 12 به دست آمده است. این مطالعه نشان داد که میکروبیوم‌های روده باستانی بیشتر به جمعیت‌های غیرصنعتی معاصر شباهت دارند تا به جمعیت‌های صنعتی (اصطلاح صنعتی در اینجا به جمعیت‌های پسا صنعتی و همچنین آنهایی که در مراحل پیشرفته و در حال صنعتی شدن هستند اشاره دارد).

با این حال، سن‌های نسبتا اخیر دیرینه‌های موجود (حدود 1000 تا 2000 سال)، همراه با چالش‌های تجزیه و تحلیل DNA باستانی تخریب‌شده، تعیین اینکه آیا این دودمان‌های میکروبی به طور صادقانه در بازه‌های زمانی طولانی تکاملی (حدود 10،000 تا 10 سال اخیر یا بیش از 10،000 تا 10 سال به دست آمده) منتقل شده‌اند، دشوار می‌سازد.

روش‌های ژنومیک مقایسه‌ای یک رویکرد جایگزین برای استنباط تاریخ تکاملی از الگوهای تنوع ژنتیکی در میان ژنوم‌های میکروبی معاصر ارائه می‌کنند 8، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19. با تکیه بر کار قبلی در پستانداران غیر انسانی 2، 8، 19، 20، 21، پیشرفت‌ها در متاژنومیکس حل‌شده با سویه، استفاده از این رویکرد را بر روی گونه‌های میکروبی روده نمونه‌برداری شده از جمعیت‌های انسانی در سراسر جهان ممکن کرده است.

کار قبلی همبستگی‌های فیلوژنتیکی بین ژنوم‌های میکروبی روده و جمعیت‌های انسانی منشأ آنها را شناسایی کرده است، که به طور بالقوه با ارتباط‌های طولانی‌مدت همخوانی دارد (18، 22، 23). با این حال، تفسیر این همبستگی ها همچنان چالش برانگیز است، زیرا آنها نیاز به مقایسه ژنوم در سطح زیرگونه یا سویه دارند. روش‌های فیلوژنتیک مرسوم 24 اغلب در چنین تنظیماتی شکست می‌خورند، زیرا انتقال ژن درون گونه‌ای و نوترکیبی همولوگ بین سویه‌ها، الگوهای موزاییکی از اجداد را تولید می‌کنند که نمی‌توانند توسط یک درخت فیلوژنتیک منفرد نشان داده شوند.

این نرخ های بالای بازترکیب، تشخیص مهاجرت مشترک باستانی از دیگر منابع ساختار جمعیت، مانند جغرافیا یا تنوع سبک زندگی میزبان را دشوار می کند. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل‌های موجود در سطح سویه نسبت به گونه‌های میکروبی روده در جمعیت‌های صنعتی تعصب دارند. این سوگیری‌های نمونه‌گیری توانایی ما را برای استنباط تاریخچه تکاملی گونه‌های میکروبی که محتمل‌ترین نامزدها برای مهاجرت مشترک اجدادی هستند، مختل کرده است.

برای پرداختن به این چالش‌ها، ما توالی‌یابی متاژنومیک عمیقی را بر روی نمونه‌های مدفوع باغبانان Tsimane بولیوی انجام دادیم (که قبلا با استفاده از توالی‌یابی RNA ریبوزومی 16S مشخص شده بود) و میکروبیوم‌های آن‌ها را با میکروبیوم‌های شکارچی-جمع‌آور Hadza از تانزانیا مقایسه کردیم. این دو گروه، جمعیت‌های معاصر منحصربه‌فرد و از نظر جغرافیایی دوری را نشان می‌دهند که اجدادشان هزاران سال پیش از هم جدا شده‌اند و فرصتی نادر برای بررسی الگوهای مهاجرت مشترک انسان و میکروارگانیسم در طیف گسترده‌ای از گونه‌های میکروبی اجدادی نامزد ارائه می‌دهند.

ما بیش از 1200 گونه میکروبی مشترک بین دو جمعیت را شناسایی کردیم که بیشتر آنها (60٪) در جمعیت های صنعتی نادر بودند یا وجود نداشتند. با استفاده از آنالیزهای ژنتیکی جمعیت که به صراحت نوترکیبی میکروبی را توضیح می‌دهند، شواهدی از جداسازی تولید مثلی در سطح فشار ارائه می‌کنیم که قوی‌تر از آن چیزی است که در میکروارگانیسم‌های جمعیت‌های صنعتی مشابه مشاهده می‌شود.

این یافته‌ها حفظ نسلی جوامع میکروبی روده را در طول مهاجرت‌های انسان باستان نشان می‌دهد، و بینش‌هایی را درباره نقش انتقال افقی ژن و تکامل مشترک میزبان و میکروارگانیسم در ساختار طولانی‌مدت میکروبیوم انسانی ارائه می‌دهد.

مردم Tsimane علوفه‌گران بومی هستند که در آمازون بولیوی زندگی می‌کنند. افراد این گروه در شش روستا در امتداد رودخانه مانیکو و سه روستا در یک منطقه جنگلی مجاور زندگی می کنند. ما توالی متاژنومی عمیق را بر روی 133 نمونه مدفوع جمع آوری شده از 85 بزرگسال Tsimane در سال های 2009 و 2012-2013 انجام دادیم (عمق متوسط ​​= 31.9 گیگابایت؛ داده های توسعه یافته شکل 1a). ما 12746 ژنوم مونتاژ شده با متاژنوم (MAGs) را بازیابی کردیم که نشان دهنده 1408 گونه باکتریایی و باستانی بود (شکل 1a، روش ها و جدول تکمیلی 1).

سپس این ژنوم‌ها را با مجموعه مشابهی از 32034 MAG که قبلا از نمونه‌های میکروبیوم توالی‌یابی عمیق 137 شکارچی-گردآورنده Hadza در تانزانیا 3 به دست آمده بود مقایسه کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1b) تا چگونگی غواصی گونه‌های میکروبی روده این جمعیت‌ها در 010 سال گذشته را تعیین کنیم.

a، تنوع طبقه بندی گونه های میکروبی بازیابی شده از میکروبیوم های Tsimane و Hadza، رنگ آمیزی بر اساس شاخه باکتریایی. ب، گونه های میکروبی مشترک بین جمعیت ها. ج، ANI برای جفت‌های ژنوم هم‌نوعی از یکسان در مقابل جمعیت‌های مختلف، که در 636 گونه مشترک با حداقل چهار MAG در هر جمعیت جمع‌آوری شده است (1012124 مقایسه ANI ژنوم دوتایی درون گونه‌ای). در داخل، توزیع های مربوطه برای مقادیر ANI بیشتر از 99.75٪ (n = 10927 مقایسه ژنوم دوتایی درون گونه ای).

H–H، Hadza–Hadza; T–H، Tsimane–Hadza; T–T، Tsimane–Tsimane. خط مرکزی نشان دهنده میانه است. کران جعبه نشان دهنده صدک های 25 و 75 است (محدوده بین ربعی، IQR). سبیل ها تا شدیدترین مقادیر در 1.5 × IQR گسترش می یابند. نقاط به صورت جداگانه به صورت پرت رسم می شوند. نتایج برای هر گونه در داده های توسعه یافته شکل 6 نشان داده شده است.

علیرغم جدایی زیاد جغرافیایی و عدم تماس مستقیم تاریخی، 87.4 درصد (1231) از گونه های گروه Tsimane نیز در افراد هادزا یافت شد (شکل 1b). برخی از این گونه های مشترک (به عنوان مثال، Ruminococcus bromii) نیز در سراسر جهان شایع هستند، اما اکثر آنها (60.2٪؛ 848 گونه) در میکروبیوم های مدفوع جمعیت های صنعتی نادر هستند یا در آنها وجود ندارند (تکمیل داده های شکل 2 و 3 و جدول تکمیلی 2). نتایج مشابهی هنگام کنترل توالی‌یابی نقاط پرت عمق بین جمعیت‌ها به دست آمد (داده‌های توسعه‌یافته شکل.

2d) یا هنگام استفاده از تجزیه و تحلیل مبتنی بر نقشه برداری برای رد تعصبات اسمبلی رایج (داده های توسعه یافته شکل 3). با این حال، تفاوت در ناهمگنی سطح کرنش و/یا توزیع عمق توالی بین گروه‌ها ممکن است به بازیابی افتراقی برخی از MAGهای نادر کمک کرده باشد. اشتراک گونه ها بین جمعیت های دور می تواند ناشی از مهاجرت مشترک باستانی یا کسب جدیدتر از محیط یا تماس انسانی باشد.

ما به دنبال تمایز بین این سناریوها با بررسی تنوع ژنتیکی در هر یک از این گونه‌های مشترک و مقایسه این الگوها با انتظارات از مهاجرت‌های تاریخی انسانی بودیم.

به عنوان اولین گام، ما میانگین هویت نوکلئوتیدی (ANI) را بین تمام جفت‌های MAG در هر یک از 636 گونه مشترک با حداقل چهار MAG در هر دو گروه هادزا و تسیمان محاسبه کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 4). این مقادیر ANI یک کران بالایی در زمان آخرین جد مشترک برای هر جفت MAG ارائه می دهند. تخمین‌های ساعت مولکولی در باکتری‌های روده نشان می‌دهد که جهش‌ها با سرعت حداقل 7-10 در هر محل در سال تجمع می‌یابند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5 و روش‌های تکمیلی 1). ANI معمولی بین Tsimane و Hadza MAGها (حدود 98٪؛ شکل 1).

1c) بنابراین نشان می دهد که آنها در 100000 تا 200000 سال گذشته یک جد ژنتیکی مشترک داشتند (داده های توسعه یافته شکل 5). این واقعیت که اکثر گونه‌های موجود در نمونه‌های Tsimane اجداد مشترکی با گونه‌های هادزا در این بازه زمانی دارند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 6) محدودیت‌های شدیدی را بر تاریخچه تکاملی قبلی آنها ایجاد می‌کند و نشان می‌دهد که اجداد Tsimane مجموعه کاملا جدیدی از میکروارگانیسم‌های روده را در طول یا پس از مهاجرت به جمعیت آمریکا به دست نیاورده‌اند.

بینش های بیشتر را می توان با مقایسه مقادیر ANI بین جفت های ژنوم Tsimane-Hadza و همتایان درون جمعیتی مربوطه آنها (Tsimane-Tsimane، Hadza-Hadza) به دست آورد. همانطور که انتظار می‌رفت، این داده‌ها نشان داد که جفت‌های ژنوم هم‌اختصاری از یک جمعیت انسانی، به‌طور میانگین، بیشتر شبیه به یکدیگر هستند تا ژنوم‌های جمعیت‌های مختلف (001/0 P <، تجزیه و تحلیل واریانس، شکل 1c). با این حال، اندازه اثر کوچکتر از تغییرات در هر جمعیت بود (میانگین شاخص تثبیت (F ST) = 0.10؛ داده های توسعه یافته شکل 6).

همپوشانی گسترده بین این توزیع‌ها نشان می‌دهد که بسیاری از تنوع سطح سویه در جمعیت‌های میکروبی Tsimane قبل از شروع انزوای جغرافیایی است.

اگرچه میانگین مقادیر ANI تمایز جغرافیایی کمی را نشان می‌دهد، ما روند بسیار قوی‌تری را در دم پر ANI توزیع مشاهده کردیم (>99.75%) که نشان‌دهنده غنی‌سازی مشخص جفت‌ها در جمعیت‌ها در مقایسه با بین جمعیت‌ها است (P <2.2 × 10-16، Wilcoxon rank-sum test، شکل 1c). این غنی‌سازی درون جمعیتی نشان می‌دهد که در تاریخ تکاملی اخیر، انتقال فشار محدودی بین این جمعیت‌ها وجود داشته است، که مطابق با واگرایی ناشی از جدایی تاریخی به جای تبادل مداوم است.

با این حال، تخمین زمان بندی این جداسازی می تواند چالش برانگیز باشد، زیرا این مقادیر بالای ANI اغلب به شدت تحت تأثیر نوترکیب با سویه های دیگر 25، 28، 30 قرار می گیرند. کار قبلی نشان داده است که این جفت‌های ANI بالا نشان‌دهنده سویه‌های تقریبا کلونال هستند که دارای ژنوم‌هایی هستند که هنوز با بازترکیب 25، 28، 31 بازنویسی نشده‌اند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5 و روش‌های تکمیلی 3). اصل و نسب کلونال آن‌ها را می‌توان از امتداد بزرگ توالی‌های DNA تقریبا یکسان، که با بخش‌های نوترکیب از سویه‌های دیگر در هم آمیخته است، استنباط کرد.

ما مقدار کل نسب کلونال را برای هر جفت MAG با استفاده از کسر ژن های هسته با توالی های DNA یکسان تخمین زدیم (شکل 2a). با کالیبره کردن این تخمین‌ها با میزان تجمع جهش در مناطق ژنومی به‌طور عمودی به ارث رسیده، تعیین کردیم که جفت‌های MAG با بیش از 10 درصد ژن‌های یکسان با سویه‌های کلونال مطابقت دارند که یک اجداد مشترک اخیر در حدود 5000 سال گذشته داشته‌اند (شکل 2a,b, شکل 2a,b, . روش 3).

با استفاده از این آستانه، ما تمام جفت‌های این گونه سویه‌های کلونال را در میان 636 گونه مشترک در شکل 1c شناسایی کردیم تا چشم‌انداز انتقال سویه اخیر بین Tsimane و Hadza را بررسی کنیم.

a، b، رابطه بین ANI و اشتراک ژن یکسان بین جفت MAG برای گونه Bulleidia sp905194705 (a) و برای 636 گونه باکتری فراوان مشترک بین Tsimane و Hadza (b). خطوط چین دار خاکستری نشان دهنده آستانه ژنی 10 درصد یکسان است که برای تعریف دودمان های اخیرا جدا شده استفاده می شود. آستانه در بین گونه ها متفاوت است، از تقریبا 4000 سال برای Bulleidia sp905194705 تا میانه حدود 2000 سال (95٪ محدوده بین صدکی: 500-5000 سال) برای گروه گونه در b (داده های توسعه یافته شکل 8).

درصد جفت‌های MAG که بالای خطوط تیره خاکستری قرار می‌گیرند نشان داده شده است. ستاره‌ها نشان می‌دهند که درصد MAGهایی که بیش از 10 درصد ژن‌های یکسان را به اشتراک می‌گذارند، برای Bulleidia sp905194705 (P<0.001 تنظیم‌شده، آزمون جایگشت یک‌طرفه با تصحیح بنجامینی-هوچبرگ) و همه گونه‌ها (P<10-test-4) به‌طور قابل‌توجهی بیشتر از حد انتظار است. ج، مکان پنج گروه مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل جهانی به اشتراک گذاری فشار بین جمعیتی. داده های آسیا 32، اروپا 33، آمریکای شمالی 34 و قوم هادزا 3 از مطالعات منتشر شده قبلی هستند.

دایره های خاکستری و خطوط چین دار خاکستری به ترتیب نشان دهنده نرخ های اشتراک نسب اخیر در جمعیت ها (H-H و T-T) و بین جمعیت ها (T-H) هستند. d، تعداد گونه‌ها (مجموع n = 636) با نرخ اشتراک کرنش T-H 0٪، 0-5٪ و 5-100٪. تعداد گونه هایی با نرخ اشتراک کرنش T-H 0٪ به طور قابل توجهی بالاتر از حد انتظار است (P <10-4، آزمون جایگشت یک طرفه). درج، نرخ به اشتراک گذاری سویه برای همه مقایسه‌های بین جمعیتی گونه‌هایی که اخیرا 5 تا 100 درصد دودمان مشترک بودند. داده ها میانگین ± s.e.m هستند. در سراسر گونه ها

e، نرخ اشتراک درون و بین جمعیت برای هشت گونه با طیف وسیعی از رفتارهای مختلف. بالا، چهار گونه با نرخ اشتراک سویه T-H 0٪. پایین، چهار گونه با نرخ اشتراک سویه T-H بیش از 5٪. اندازه نقطه تعداد MAG ها را در هر جمعیت نشان می دهد، با نقاطی که در c قرار می گیرند (بدون نقطه به معنای عدم وجود MAG است). ضخامت خط نشان دهنده نرخ اشتراک دودمان اخیر است.

مقایسه‌های جمع‌آوری‌شده در تمام 636 گونه نشان داد که در مجموع، 78746 جفت MAG (7.8٪) با این معیار به صورت کلونی مرتبط بودند، که نشان می‌دهد که آنها یک جد مشترک جدید را حداکثر در حدود 5000 سال پیش به اشتراک گذاشته‌اند (5ka؛ شکل 2b,c). بسیاری از این جفت های مرتبط با کلون (93.8٪) در مقایسه های درون جمعیتی یافت شدند، که نشان می دهد که بیشتر روابط اخیر در همان جمعیت انسانی رخ داده است (P <10-4، آزمون جایگشت).

علاوه بر این، چند جفت سویه کلونال مشترک بین Tsimane و Hadza به طور نابرابر در بین گونه ها توزیع شدند، با 545 گونه از 636 گونه (85.6٪) هیچ اشتراک سویه اخیر بین دو جمعیت را نشان ندادند (شکل 2d؛ P <10-4، آزمون جایگشت). این نتایج نشان می‌دهد که در اکثر گونه‌های مشترک، به اشتراک گذاری سویه بسیار محدودی بین Tsimane و Hadza در حدود 5000 سال گذشته رخ داده است.

با این حال، برخی استثناهای قابل توجه برای این روند به اشتراک گذاری فشار بین جمعیتی محدود وجود داشت. برخی از گونه‌ها دارای سطوح اشتراک سویه Tsimane-Hadza قابل مقایسه با خطوط پایه درون جمعیتی خود بودند که با گسترش اخیر سازگار بود. این گونه ها، که شامل Akkermansia muciniphila و Bacteroides ovatus (شکل 2e، پایین)، تمایل دارند در جمعیت های صنعتی غنی شوند. برای بررسی بیشتر این الگو، تجزیه و تحلیل خود را گسترش دادیم تا 8855 MAG اضافی از اروپا، آسیا و آمریکای شمالی 32، 33، 34 را شامل شود.

نتایج نشان داد که این گونه‌های Tsimane-Hadza که اخیرا به اشتراک گذاشته شده‌اند همچنین دارای MAGهای مرتبط نزدیک هستند که در سطح جهانی توزیع شده‌اند (شکل 2c-e و داده‌های توسعه یافته شکل 8). این نشان می‌دهد که گونه‌هایی با نرخ اشتراک‌گذاری سویه Tsimane-Hadza بالا از طریق تعاملات اخیر با سایر جمعیت‌های انسانی به Tsimane و Hadza معرفی شده‌اند.

قابل‌توجه، مقایسه با MAGهای صنعتی نیز کلاس دیگری از گونه‌ها را نشان داد که در سبک‌های زندگی رایج است، اما انتقال سویه اخیر بین Tsimane و Hadza را نشان نمی‌دهد (شکل 2e و داده‌های توسعه‌یافته شکل 8). این گونه‌ها که شامل گونه‌های رایجی مانند آگاتوباکتر رکتالیس و رومینوکوکوس برومی هستند، نشان می‌دهند که سویه‌های Tsimane و Hadza می‌توانند با وجود شیوع جهانی و اشتراک اخیر این گونه‌ها در جمعیت‌های صنعتی، جدا باقی بمانند.

یکی از محدودیت‌های معیارهای اشتراک‌گذاری کرنش این است که تعداد کل جفت‌های کلونال توسط عوامل متعددی شکل می‌گیرد، مانند شبکه‌های تماس میزبان 35، 36 و جابجایی‌های انتخابی در سطح ژنوم 37، که مقایسه آنها در بین جمعیت‌ها دشوار است. برای تأیید بیشتر مشاهدات خود از جداسازی میکروبی بین Tsimane و Hadza (شکل 2)، ما از یک رویکرد متعامد استفاده کردیم که شامل اطلاعات جفت‌های باقی‌مانده MAGها (یعنی آنهایی با کمتر از 10٪ ژن‌های یکسان) بود.

اگرچه اصل و نسب کلونال اصلی آنها توسط نوترکیبی با سویه‌های دیگر بازنویسی شده است، رویدادهای نوترکیبی اخیر بین اجداد این سویه‌های مرتبط با فاصله بیشتر، بخش‌های کوتاه‌تری از DNA تقریبا یکسان را در مقابل پس‌زمینه ANI در سطح ژنوم پایین‌تر (95-99٪) ایجاد می‌کنند (شکل 3a). رویدادهای جهش و نوترکیبی بعدی به تدریج این بخش‌ها را در طول زمان تخریب می‌کنند و رابطه‌ای بین طول یک امتداد یکسان از DNA و سن رویداد انتقال ایجاد می‌کنند.

زمان‌بندی این رویدادها را می‌توان برای اندازه‌گیری نرخ‌های جریان ژن‌های میکروبی تاریخی در درون جمعیت‌های انسانی در مقایسه با بین جمعیت‌های انسانی مورد استفاده قرار داد - امضای ژنتیکی مرسوم که نشان می‌دهد آنها بخشی از همان جمعیت میکروبی بودند (38).

a، نوترکیب، مسیرهای ژنومی طولانی و یکسانی را بین سویه ها ایجاد می کند که با جهش های بعدی کوتاه می شوند. این یک رابطه مشخصه بین طول دستگاه و سن انتقال ایجاد می کند (روش های تکمیلی 4). جداسازی تولیدمثلی باعث می‌شود که مسیرهای طولانی بین جمعیت‌ها از انتقال‌های قدیمی‌تر و قبل از جداسازی ناشی شود، که منجر به طول مجرای تجمعی کوتاه‌تر در مقایسه با مقایسه‌های درون جمعیتی می‌شود. از این تفاوت می توان برای پی بردن به زمان جداسازی ژنتیکی استفاده کرد. Syn., مترادف; SNV، نوع تک نوکلئوتیدی.

b، نمودار تابع توزیع تجمعی تجربی طول مسیر برای دو گونه نمونه، مقایسه بین و درون جمعیت Tsimane و Hadza. bp، جفت پایه. خطوط چین نشان دهنده طول L99 است. مقادیر P تنظیم شده (P adj) با نتایج آزمایش جایگشت یک طرفه مطابقت دارد (با تصحیح بنجامینی-هوچبرگ، روش‌های تکمیلی 4). ج، مقایسه معیارهای L99 برای چندین جفت جمعیت (Tsimane–Hadza، آسیا–آمریکای شمالی و آمریکای شمالی–اروپا).

مقادیر P نشان‌دهنده نتایج آزمون‌های جمع رتبه‌ای Wilcoxon است که نتایج مقادیر L99 بین و درون جمعیتی را برای هر جفت جمعیت مقایسه می‌کند. د، زمان تقسیم جمعیت تخمینی برای هر گونه. فواصل اطمینان 95% برای هر گونه (روش های تکمیلی 4) در جدول تکمیلی 3 فهرست شده است. *** P <10-4 برای مقایسه تخمین‌های زمان تقسیم Tsimane-Hadza با تخمین‌های آسیا-آمریکای شمالی و اروپا-آمریکای شمالی (آزمون U دو طرفه Mann-Whitney).

ما این سیگنال را با شناسایی طولانی‌ترین قسمت مکان‌های مترادف یکسان بین هر جفت MAG برای هر یک از 636 گونه مشترک، کمی کردیم (گونه‌های نماینده در شکل 3b نشان داده شده‌اند). ما جفت‌های کلونال (بیش از 10 درصد ژن‌های یکسان) را برای تمرکز بر جریان ژن به جای DNA به‌دست‌آمده از نسب مشترک کنار گذاشتیم (همانطور که در شکل 2 تحلیل شد). تفاوت‌ها در طول دستگاه برای مقایسه‌های درون جمعیتی در مقابل مقایسه‌های بین جمعیتی در بخش‌های طولانی‌تر، همزمان با رویدادهای نوترکیبی اخیر، آشکارتر بود (شکل 3b و روش‌های تکمیلی 4).

بنابراین، برای کمی کردن این روند به طور سیستماتیک، صدک 99 طول مسیر (طول L99) را برای هر یک از 636 گونه محاسبه کردیم.