وابستگی مهندسی شده به TYK2 آگونیسم گیرنده IL-10 انتخابی میلوئیدی را فعال می کند

اینترلوکین-10 (IL-10) یک سایتوکین ضد التهابی مرکزی است که پاسخ های ایمنی را در سلول های میلوئیدی سرکوب می کند، اما می تواند سلول های T را نیز فعال کند و استفاده درمانی آن را در بیماری های التهابی مزمن به دلیل محدودیت های پنجره های اثربخشی و سمیت های محدود کننده دوز محدود می کند. در اینجا ما نشان می‌دهیم که سلول‌های میلوئید و T در وابستگی به جفت شدن کیناز خانواده JAK برای سیگنال‌دهی و عملکرد IL-10 متفاوت هستند.

ما از این وابستگی دیفرانسیل کیناز برای مهندسی آگونیست گیرنده IL-10 انتخابی میلوئیدی مبتنی بر نانوبادی چهار ظرفیتی (آگونیست msIL-10R) استفاده کردیم که به طور کامل سرکوب قوی IL-10 از مونوسیت ها، ماکروفاژها و سلول های T دندریتیک را بازبینی می کند. تجزیه و تحلیل ساختاری میکروسکوپ کرایو الکترونی هندسه پیوند متقابل گیرنده مجزای آگونیست msIL-10R را در مقایسه با سایتوکاین‌های خانواده IL-10 نشان می‌دهد.

این معماری چهار ظرفیتی، سیگنال دهی را به شدت وابسته به TYK2 و بسیار حساس به فراوانی گیرنده IL-10Rα و IL-10Rβ می کند، در نتیجه فعالیت انتخابی در سلول های میلوئیدی ایجاد می کند. این آگونیست msIL-10R التهاب را در مدل‌های موش انسان‌سازی‌شده با چالش لیپوپلی‌ساکارید، حساسیت نوع تاخیری و کولیت کاهش می‌دهد. نسخه انسانی دارای فارماکوکینتیک IgG مانند، اشغال گیرنده پایدار و سرکوب بادوام میلوئیدی تا 30 روز بدون فعال شدن سلول T یا سمیت های خونی در پستانداران غیر انسانی است.

این یافته‌ها یک استراتژی مبتنی بر هندسه را برای دستیابی به سیگنال‌دهی سیتوکین انتخابی نوع سلولی ایجاد می‌کند و آگونیست msIL-10R را به عنوان یک کاندید درمانی برای بیماری‌های التهابی ناشی از میلوئید، از جمله بیماری‌های التهابی روده، شناسایی می‌کند.

IL-10 یک سایتوکین ضد التهابی قوی است که تحمل ایمنی را حفظ می کند 1، 6. جهش های از دست دادن عملکرد در IL10 یا گیرنده های آن IL10RA (رمز کننده IL-10Rα) و IL10RB (رمزکننده IL-10Rβ) باعث بیماری التهابی روده زودرس (IBD) و اختلالات خود التهابی می شوند. سیگنال دهی IL-10 زمانی آغاز می شود که IL-10 به IL-10Rα و IL-10Rβ متصل می شود تا یک کمپلکس گیرنده تترامری تشکیل دهد که به ترتیب با Janus kinase 1 (JAK1) و تیروزین کیناز 2 (TYK2) مرتبط است.

این اتصال باعث فسفوریلاسیون وابسته به JAK1 IL-10Rα و مبدل سیگنال و فعال کننده رونویسی 3 (STAT3) می شود تا بیان ژن پیش التهابی را سرکوب کند و تحمل ایمنی را ارتقا دهد 8، 9. IL-10 عمدتا اثرات تحمل‌زایی خود را در سلول‌های میلوئیدی و سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن، مانند سلول‌های دندریتیک (DCs) و ماکروفاژها، با مهار تولید سیتوکین، ارائه آنتی‌ژن و پرایمینگ سلول T اعمال می‌کند. از دست دادن IL10RA یا STAT3 در این سلول ها منجر به کولیت و التهاب سیستمیک می شود 10، 12، 13.

علیرغم نقش اصلی آن در تحمل ایمنی، عملکرد دوگانه IL-10 کاربرد درمانی آن را به شدت محدود می کند. در حالی که IL-10 به شدت التهاب را در سلول های میلوئیدی سرکوب می کند، غلظت های بالاتر سلول های T را فعال می کند، میلوپوئیزی وابسته به IFNγ را تقویت می کند و تعداد پلاکت ها و گلبول های قرمز را کاهش می دهد 2، 4، 5، 15. آزمایش‌های بالینی اولیه در بیماری کرون و پسوریازیس یک پنجره درمانی باریک با کم خونی محدودکننده دوز و ترومبوسیتوپنی ناشی از فعال‌سازی ناخواسته سلول‌های T و B را نشان داد.

برعکس، توانایی آن در افزایش عملکرد سلول‌های T سیتوتوکسیک و تمایز سلولی کمکی نوع 1 (TH1) باعث ایجاد IL-10 پگیله شده به عنوان یک ایمونوتراپی سرطان برای تومورهای جامد شده است. با این حال، شاخص درمانی محدود IL-10، ناشی از این اثرات ضد سرکوب کننده سیستم ایمنی و تحریک کننده سیستم ایمنی به همراه سمیت های خونی، یک مانع اصلی باقی می ماند 16، 17، 18. تلاش های قبلی برای مهندسی انواع انتخابی IL-10 به دلیل نیمه عمر کوتاه، ایمنی زایی و جداسازی ناقص فعالیت های مفید و مضر محدود شده است.

فعال سازی کینازهای خانواده JAK نیاز به دیمریزاسیون با واسطه گیرنده دارد که ترانس فسفوریلاسیون را قادر می سازد 21، 22. IL-10 بومی یک دایمر تعویض شده با دامنه است 19، 23 که یک کمپلکس سیگنالینگ (IL-10Rα) 2-(IL-10Rβ) 2 را مونتاژ می کند و فعال سازی JAK1 را از طریق مسیرهای ترانس فسفوریلاسیون TYK2-JAK1 و JAK1-JAK1 امکان پذیر می کند (شکل 22، 2). JAK1 برای فسفوریلاسیون IL-10Rα و فعال سازی پایین دست STAT3 9 مورد نیاز است (داده های توسعه یافته شکل 1a,b).

a، شماتیک سیگنال دهی با واسطه مونومر و دایمر IL-10 از طریق ترانس فسفوریلاسیون JAK1-JAK1 و TYK2-JAK1. b، pSTAT3 میانگین شدت فلورسانس (MFI) در BMDMهای نوع وحشی (WT) یا کمبود TYK2 که با PBS یا IL-10 در حضور DMSO، VVD-118313 (VVD) یا upadacitinib (UPA) (UPA3) (n=scate) درمان شدند. درست است، غلظت TNF در رویی BMDM های تحریک شده با LPS تیمار شده با IL-10 و مهارکننده های نشان داده شده (تعداد = 5 یا 6 تکرار بیولوژیکی که از دو آزمایش جمع آوری شده اند).

c، pSTAT3 MFI در مونوسیت های خون انسان تحریک شده با IL-10 در حضور یا عدم حضور یک مهارکننده TYK2 (n = 3 اهداکننده). غلظت‌های d، TNF و IL-6 در مایع‌های رویی PBMC‌های انسانی تحریک‌شده با LPS تحت درمان با IL-10 با یا بدون مهارکننده TYK2 (n = 3 اهداکننده). e، pSTAT3 MFI در سلول‌های CD8 + T تحت درمان با IL-10 در حضور یا عدم حضور یک مهارکننده TYK2. ورودی: نمای گسترده ای از سلول های تیمار شده با مهارکننده TYK2. خط پایه نشان دهنده سطح تحریک نشده است. n = 3 اهدا کننده.

f، h، pSTAT3 (f) و گرانزیم B (h) MFI در سلول‌های CD8 + T ویرایش‌شده توسط CRISPR که ژن‌های نشان‌داده‌شده یا کنترل غیر هدف‌گیری (NTC) را پس از تحریک IL-10 هدف قرار می‌دهند. n = 3 اهدا کننده. g، غلظت گرانزیم B و IFNγ در سوپرناتانت سلول های CD8 + T تیمار شده با IL-10 در حضور یا عدم حضور مهارکننده TYK2، به سلول های بدون IL-10 نرمال شد. n = 3 اهدا کننده. FC، تغییر تا.

i-k، pSTAT3 MFI در مونوسیت ها و سلول های T (i)، غلظت های TNF و IL-6 در سوپرناتانت های PBMC تحریک شده با LPS (j)، و غلظت های گرانزیم B و IFNγ در رویی سلول های CD8 + T فعال شده (k) تیمار شده با مونومر IL-10 یا IL-10 تیتر شده. n = 3 اهدا کننده. مگر اینکه غیر از این نشان داده شود، IL-10 در 10 نانومولار استفاده شد. داده ها میانگین ± s.d هستند. نقاط نشان دهنده تکرارهای بیولوژیکی هستند.

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون‌های t زوجی دو طرفه (c – e و g) و آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) با آزمون مقایسه چندگانه دانت (b، f و h) انجام شد. * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001، **** P <0.0001; NS، قابل توجه نیست.

برای تشریح این مسیرهای سیگنالینگ، ما از یک مهارکننده آلوستریک انتخابی JAK1 (VVD-118313) استفاده کردیم که C816 موش را هدف قرار می دهد و به طور انتخابی ترانس فسفوریلاسیون JAK1 را بدون مهار دامنه های کیناز مسدود می کند. در ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان (BMDMs)، مهار ترانس فسفوریلاسیون JAK1-JAK1 توسط VVD-118313 تا حدی فسفوریلاسیون STAT3 ناشی از IL-10 را کاهش داد، اما پاسخ های عملکردی را لغو نکرد، مطابق با جبران از طریق TYK1phorybted data (شکل. 1c–e).

در BMDM های کمبود TYK2، VVD-118313 فسفوریلاسیون STAT3 و عملکرد IL-10 را به طور کامل لغو کرد، که نشان می دهد حداقل یک مسیر ترانس فسفوریلاسیون، یا JAK1-JAK1 یا TYK2-JAK1، باید برای صلاحیت سیگنال دهی دست نخورده باقی بماند. به عنوان یک کنترل، مهارکننده کیناز JAK1 رقابتی ATP (upadacitinib) به طور کامل فسفوریلاسیون STAT3 با واسطه IL-10 و سرکوب TNF و IL-6 ناشی از LPS را مسدود کرد (شکل 1b و داده های توسعه یافته شکل 1c-e).

مطابق با این یافته‌ها در BMDM‌های موش، مهار دارویی TYK2 با zasocitinib تا حدی فسفوریلاسیون STAT3 ناشی از IL-10 را در مونوسیت‌های انسانی کاهش داد (شکل 1c، داده‌های توسعه‌یافته شکل 1f و شکل تکمیلی شکل 2) اما عملکرد لیزی را تحت تأثیر قرار نداد. TNF و IL-6 القا شده توسط (LPS) در سلول های تک هسته ای خون اولیه (PBMCs) (شکل 1d). به عنوان یک کنترل، zasocitinib به طور کامل فسفوریلاسیون STAT3 ناشی از IL-23 و IFNα و سیگنال دهی پایین دست را مسدود کرد (داده های توسعه یافته شکل 2a).

ناک اوت TYK2 با واسطه CRISPR در ماکروفاژهای انسانی نتایج مشابهی ایجاد کرد (داده های توسعه یافته شکل 2b,c)، که تایید می کند که TYK2 برای مهار TNF با واسطه IL-10 و IL-6 در ماکروفاژها 24 غیرقابل استفاده است.

در مقابل، هم مهارکننده TYK2 و هم ناک اوت CRISPR فسفوریلاسیون STAT3 ناشی از IL-10 را در سلول‌های CD8 + T کاهش دادند (شکل 1e,f و داده‌های گسترده شکل‌های 1g و 2d) و به طور کامل افزایش گرانزیم B و IFNγ را کاهش دادند. TYK2 در سلول های T

ما بعدا آزمایش کردیم که آیا دامنه سیگنال‌دهی تنظیم می‌تواند از این وابستگی کیناز دیفرانسیل بهره‌برداری کند یا خیر. یک مونومر IL-10 مهندسی شده 19 که یک هترودایمر IL-10Rα-IL-10Rβ را درگیر می کند (شکل 1a) سیگنال دهی را به یک مسیر ترانس فسفوریلاسیون TYK2-JAK1 محدود می کند (داده های توسعه یافته شکل 2e-h). مونومر حدود 50% حداکثر فسفوریلاسیون STAT3 را در مونوسیت های خون القا کرد، اما سرکوب قابل توجهی TNF و سرکوب جزئی IL-6 را حفظ کرد (شکل 1i,j). در سلول های T، مونومر فسفوریلاسیون STAT3 را القا نکرد (شکل 1i، داده های توسعه یافته شکل 1g و شکل تکمیلی.

2) یا افزایش تولید IFNγ و گرانزیم B (شکل 1k). این داده‌ها آستانه‌های متمایزی را در بین انواع سلول نشان می‌دهند: سلول‌های میلوئیدی ورودی ضعیف‌شده را تحمل می‌کنند، در حالی که سلول‌های T به حداکثر سیگنال‌دهی نیاز دارند که انتخاب میلوئید طبیعی را با آگونیست‌های ضعیف‌شده ممکن می‌سازد.

در مجموع، این مشاهدات نشان می‌دهد که وابستگی طبیعی نوع سلول ایمنی به TYK2، همراه با قدرت سیگنال‌دهی تنظیم، می‌تواند برای تولید آگونیست‌های انتخابی IL-10 که سرکوب سیستم ایمنی میلوئید را از تحریک سلول‌های T جدا می‌کند، مورد سوء استفاده قرار گیرد.

اگرچه لیگاندهای ضعیف شده مانند مونومر IL-10 و موتئین های IL-10 تنظیم شده با میل ترکیبی، اثبات مفهومی در شرایط آزمایشگاهی برای انتخاب میلوئید 20 ارائه می کنند، پتانسیل درمانی آنها به دلیل حساسیت به آنتی بادی های طبیعی ضد IL-10، کاهش ناپایداری حرارتی T-F و کاهش ناپایداری حرارتی برای N6، محدود می شود. (شکل 1j)، و فعال سازی سلول های T و B باقی مانده 20. برای غلبه بر این محدودیت‌ها و فعال کردن کنترل دقیق سیگنال‌دهی IL-10R، ما یک رویکرد آنتی‌بادی تک دامنه (nanobody) را دنبال کردیم.

نانوبادی ها به دلیل اندازه کوچک (12-14 کیلو دالتون)، میل ترکیبی بالا و ویژگی های توسعه پذیری مطلوب برای آگونیسم گیرنده مناسب هستند.

آلپاکاها با دامنه خارج سلولی IL-10Rα انسان (ECD)، IL-10Rβ ECD یا یک پروتئین همجوشی هترودیمری Fc IL-10Rα-IL-10Rβ (شکل 2a) ایمن شدند. دامنه سنگین متغیر از مجموعه‌های زنجیره سنگین (VHH) مشتق‌شده از سلول‌های B برای ساخت کتابخانه‌های فاژ استفاده شد، که از آنها خانواده‌های ضد IL-10Rα و anti-IL-10Rβ VHH جدا شدند (جدول تکمیلی 1 و 2).

جفت‌های VHH به‌عنوان پروتئین‌های همجوشی Fc با برچسب دایمر 6×His یا تترامر، با ضد IL-10Rα یا anti-IL-10Rβ در انتهای N قرار گرفتند و با رده سلولی گزارشگر STAT3 IL-10Rα-IL-10Rβ غربالگری شدند (شکل).

یک، شماتیک ایمن سازی آلپاکا با IL-10Rα، IL-10Rβ یا IL-10Rα-IL-10Rβ پروتئین Fc-fusion هترودیمری انسانی، به دنبال ساخت کتابخانه فاژ VHH و غربالگری آگونیست های چهار ظرفیتی IL-10R. ب، غربالگری نامزدهای نانوبادی چهار ظرفیتی در یک سنجش گزارشگر STAT3-لوسیفراز با استفاده از سلول‌های HEK293T که به طور پایدار IL-10Rα و IL-10Rβ را بیان می‌کنند. ج، طراحی آگونیست msIL-10R. d، سرکوب وابسته به دوز IL-6 و TNF در PBMC های انسانی تحریک شده با LPS تحت درمان با آگونیست IL-10، msIL-10R یا آگونیست pan-IL-10R. n = 3 اهدا کننده.

خطوط نشان دهنده رگرسیون غیر خطی چهار پارامتری متناسب با داده های دوز-پاسخ هستند. القاء وابسته به دوز IFNγ در سلول‌های CD8 + T تحریک‌شده با CD3/CD28 که به مدت 3 روز با آگونیست‌های نشان‌داده‌شده درمان شدند. n = 3 اهدا کننده. خطوط نشان دهنده رگرسیون غیر خطی چهار پارامتری متناسب با داده های دوز-پاسخ هستند. f، pSTAT3 MFI در مونوسیت ها و سلول های CD8 + T از خون کامل تحت درمان با آگونیست IL-10 یا msIL-10R به مدت 15 دقیقه. n = 2 اهدا کننده.

g، تجزیه و تحلیل RNA-seq از PBMC های انسانی تیمار شده با PBS، 10 نانومولار IL-10-Fc یا آگونیست msIL-10R به مدت 24 ساعت در غیاب (سمت چپ) یا حضور (راست) 1 نانوگرم در میلی لیتر -1 LPS. n = 3 اهدا کننده. بیان ژن دیفرانسیل (تغییر برابر log2-تبدیل شده نسبت به PBS) برای آگونیست IL-10-Fc و msIL-10R مقایسه شد. h، بیان ژن دیفرانسیل در سلول های CD8 + T فعال شده با IL-10-Fc (سمت چپ) یا آگونیست msIL-10R (راست) به مدت 24 ساعت نسبت به PBS. n = 3 اهدا کننده.

بیان دیفرانسیل با استفاده از edgeR تجزیه و تحلیل شد. اهمیت با استفاده از آزمون F شبه احتمال دو طرفه با تصحیح FDR بنجامینی-هوچبرگ تعیین شد. تمام داده ها همان طور که نشان داده شد، تکرارهای بیولوژیکی هستند. داده ها میانگین ± s.d هستند. نمودارهای a و c با استفاده از BioRender ایجاد شدند. یی، تی. https://biorender.com/juf8dyp (2026).

در میان 882 ترکیب آزمایش شده، 182 سازه فعالیت های گزارشگر STAT3 را نشان دادند و 21 مولکول بیش از 90٪ TNF و بیش از 85٪ مهار IL-6 را در PBMC های انسانی تحریک شده با LPS به دست آوردند (شکل تکمیلی 3). با این حال، اکثر نانوبادی‌های آگونیست چهار ظرفیتی IL-10R، درجاتی از پروفایل تحریک‌کننده سلول‌های T IL-10 بومی را خلاصه می‌کنند، همانطور که با افزایش ترشح IFNγ و گرانزیم B توسط سلول‌های CD8 + T مشهود است و نمونه‌ای از آگونیست pan-IL-10R است.

گزینش پذیری و قدرت بسیار خاص کلون بود. یک ساختار چهار ظرفیتی (شکل 2c) قدرت پیکومولار را همراه با گزینش میلوئیدی تقریبا کامل نشان داد: نیمه حداکثر غلظت بازدارنده (IC50) 2.1 pM برای TNF القاء شده با LPS و 6.9 pM برای IL-6 در سلول‌های PBMCs، بدون القای سلول‌های BBMC یا granzyme IFNγ. تکثیر (شکل 2d,e و داده های توسعه یافته شکل 3a-d). ما این مولکول را به عنوان آگونیست IL-10R انتخابی میلوئیدی (از این پس آگونیست msIL-10R) تعیین کردیم.

تجزیه و تحلیل رزونانس پلاسمون سطحی (SPR) اتصال با میل ترکیبی بالا به IL-10Rα انسان (KD = 2.8 نانومولار) و IL-10Rβ (KD = 1.1 نانومولار) را با میل ترکیبی قابل ملاحظه‌ای بالاتر برای IL-10Rβ نسبت به IL-10 بومی تأیید کرد (تکمیلی 5 و 3 تکمیلی).

آگونیست msIL-10R در مقایسه با موتئین 20 IL-10 IL-10 با میلوئید بایاس با میل ترکیبی، انتخاب لنفوسیت بهبود یافته ای را نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 3a-d). در حالی که موتئین‌های IL-10 10DE و D25K تقریبا 30٪ حداکثر فسفوریلاسیون STAT3 را در سلول‌های T حفظ کردند و تولید IFNγ را القا کردند، آگونیست msIL-10R حداقل سیگنال‌دهی (<10% E max) را در سلول‌های CD4 + T و سلول‌های T Ex. 3a-c و شکل تکمیلی 6) و برنامه موثر سیتوتوکسیک را القا نکرد (شکل 2e و داده های توسعه یافته شکل 3c).

علاوه بر این، برخلاف موتئین‌های IL-10 و IL-10، آگونیست msIL-10R حداقل فسفوریلاسیون STAT3 (pSTAT3) را در سلول‌های B نشان داد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a,b) و گسترش سلول B یا تمایز گزینش پلاسمابلاست در سراسر داده را بهبود نداد (شکلx). جمعیت لنفوسیتی

پروفایل رونویسی توسط توالی یابی RNA (RNA-seq) پاسخ های رونویسی بسیار همبسته ای را به IL-10، IL-10-Fc و آگونیست msIL-10R در PBMC های در حال استراحت و تحریک شده با LPS، از جمله سرکوب قابل مقایسه ژن های التهابی مانند IL-10 و Fig. شکل 7). در مقابل، تنها IL-10 و IL-10-Fc ژن‌های مرتبط با سلول T سیتوتوکسیک (مانند GZMB و BCL6) را در کشت سلول‌های T فعال القا کردند، در حالی که آگونیست msIL-10R ژن‌های متفاوتی را در سلول‌های T القا نکرد (شکل 2h و تکمیلی).

با هم، از طریق غربالگری تجربی تقریبا 1000 مجموعه نانوبادی چهار ظرفیتی، آگونیست msIL-10R را شناسایی کردیم که برنامه ضد التهابی IL-10 را در سلول‌های میلوئیدی خلاصه می‌کند و در عین حال اثرات تحریک‌کننده ایمنی آن را در لنفوسیت‌ها جدا می‌کند.

آگونیست msIL-10R شامل دامنه های پشت سر هم VHH است که به داربست Fc با یک ضد IL-10Rα VHH (کلون E07) متصل به ضد IL-10Rβ VHH (کلون A05) (از این پس E07-A05) در هر بازو متصل شده است (شکل 2c). برای تعریف حالت درگیری گیرنده آن، ما ساختار میکروسکوپ کرایو الکترونی (cryo-EM) IL-10Rα ECD و IL-10Rβ ECD را در یک مجموعه با VHH پشت سر هم E07-A05 تعیین کردیم.

به دلیل اندازه کوچک کمپلکس گیرنده-VHH (حدود 78 کیلو دالتون) برای کرایو-EM، ما از یک Fab ضد VHH اخیرا توسعه یافته (NabFab؛ Fab 1) برای تسهیل تراز و بازسازی ذرات استفاده کردیم 27 . NabFab یک اپی توپ اتصال مهندسی شده را در VHH A05 دیستال پیوند دهنده E07-A05 و همه CDR ها تشخیص می دهد و بر فعالیت های بیولوژیکی تأثیر نمی گذارد (داده های توسعه یافته شکل 4 و شکل تکمیلی 9). نقشه cryo-EM مجتمع IL-10Rα-IL-10Rβ-E07-A05 به وضوح کلی 3.14 Å حل شد (شکل 3a و شکل تکمیلی 10).

وضوح محلی از 2.8 A در رابط IL-10Rβ-VHH A05 تا حدود 4 A در رابط IL-10Rα-VHH E07 متغیر است، که نشان دهنده انعطاف پذیری ساختاری بین ماژول های اتصال گیرنده است. برای تعریف بیشتر اپی توپ E07، ساختار دوم کرایو-EM از IL-10Rα ECD را در یک کمپلکس با E07 و یک Fab ضد VHH (Fab 2) با وضوح 2.40 Å تعیین کردیم (شکل 3b و شکل تکمیلی 11). ادغام این مجموعه داده ها یک مدل مولکولی ترکیبی از مجموعه کامل متصل به گیرنده را به همراه داشت (شکل 3c).

یک نقشه چگالی Cryo-EM از مجموعه VHH پشت سر هم IL-10Rα-IL-10Rβ-E07-A05 با ضد VHH Fab 1 در 3.14 Å حل و فصل شد. b، نقشه چگالی Cryo-EM مجتمع IL-10Rα-VHH E07 با ضد VHH Fab 2 در 2.40 Å حل شد. ج، مدل ساختاری ترکیبی مجتمع گیرنده IL-10Rα-IL-10Rβ-E07-A05. d، انطباق ساختارهای IL-10Rβ در کمپلکس با VHH A05 یا IL-10-IL-10Rα (PDB: 6X93). e، نمای دقیق رابط اتصال IL-10Rβ-VHH A05، برجسته کردن مخاطبین گیرنده و بازآرایی ساختاری حلقه Asn138-Trp143. f، نمای تفصیلی رابط اتصال IL-10Rα–VHH E07.

E07 یک اپی توپ را درگیر می کند که محل اتصال بین دو حوزه فیبرونکتین نوع III IL-10Rα است. g، برهم نهی مجتمع‌های گیرنده IL-10Rα-IL-10Rβ-E07-A05 (در جعبه چین‌دار صورتی) و IL-10Rα-IL-10Rβ-IL-10 (PDB: 6X93) (در جعبه نقطه‌دار سیاه). جهش IL-10Rα مرتبط با بیماری Y64C و R117C/H در رابط IL-10Rα-IL-10 به رنگ نارنجی نشان داده شده است. انواع دیگر مرتبط با IBD (W45G، T84I، L90P، Y91C، R101W، L125R، L132R، G141R، I169T، F190C و C223R/S) به رنگ زرد نشان داده شده اند.

h، درصد سلول‌های RAW264.7 تولیدکننده TNF داخل سلولی که WT یا واریانت‌های نشان‌داده‌شده IL-10Rα انسانی را پس از تحریک LPS در حضور موتئین‌های IL-10، IL-10 (10DE و D25K) یا آگونیست msIL-10R در 0.1 nM و 0.1 nM و nM، بیان می‌کنند. داده ها میانگین ± s.d هستند. n = 3 تکرار بیولوژیکی. مقایسه های آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون مقایسه چندگانه دانت انجام شد.

مقایسه با کمپلکس‌های گیرنده تشکیل‌شده توسط IL-10، IL-22 و IFNλ، سازمان گیرنده متمایز ناشی از آگونیست msIL-10R 23، 28، 29 را نشان می‌دهد. VHH A05 به یک اپی توپ روی IL-10Rβ متصل می شود که تا حدی با سطح اتصال به سیتوکین مورد استفاده توسط سیتوکین های خانواده IL-10 همپوشانی دارد. با این حال، اتصال A05 باعث ایجاد یک بازآرایی ساختاری محلی حلقه Asn138-Trp143 IL-10Rβ می‌شود، و Trp143 و Tyr140 را در شکاف ایجاد شده توسط CDR2 و CDR3 VHH A05 قرار می‌دهد (شکل 3e).

تماس های اضافی شامل CDR2 و CDR3 یک شبکه تعامل گسترده ایجاد می کند که درگیری گیرنده را تثبیت می کند (شکل 3e).

در مقابل، VHH E07 سطح بزرگی را تشخیص می دهد که محل اتصال بین دامنه های فیبرونکتین پشت سر هم نوع III IL-10Rα را در بر می گیرد (شکل 3f). این اپی توپ در طرف مقابل محل اتصال IL-10 قرار دارد و با جهش های شناخته شده IL10RA مرتبط با بیماری مرتبط با IBD 30 در تماس نیست (شکل 3g). مطابق با این مشاهدات، جهش‌های رابط اتصال به IL-10 مرتبط با بیماری در IL-10Rα (R117C، R117H و Y64C) به‌طور قابل‌توجهی سرکوب TNF توسط IL-10 بومی و تا حد بیشتری توسط IL-10 muteunte-detuning شده است.

در مقابل، آگونیست msIL-10R فعالیت کامل را در سلول‌هایی که این گونه‌های IL10RA مرتبط با بیماری را بیان می‌کنند، حفظ کرد (شکل 3h).