کاتالیز RNA از مجموعه های ساختاری پویا بیرون می آید

فعل و انفعال دینامیکی بین ساختار RNA و یون‌های Mg2+ مرتبط با آن برای عملکرد RNA مرکزی است، اما در سطح نزدیک به اتمی 1، 2، 3، 4 به خوبی درک نشده است. در اینجا، با استفاده از یک پروتکل متمرکز بر ناهمگنی برای تجزیه و تحلیل داده‌های میکروسکوپ الکترونی کرایو-الکترونی ذرات RNA انعطاف‌پذیر ساختاری، ساختار مجموعه‌های RNA RNase P متشکل از 76 کنفورمور فعال و غیرفعال را تعیین کردیم که در یک برهم‌کنش سوم گذرا که برای فعالیت حیاتی است، متفاوت هستند.

اتصال پروتئین کمکی ساختار محلی را تغییر نمی دهد، اما آلوستری ترمودینامیکی را القا می کند که با تغییر دینامیک برهمکنش سوم، کاتالیز را افزایش می دهد. چهار کلاس مجزا از یون‌های Mg 2+ نقش مهمی در ساختار، دینامیک و کاتالیز مجموعه‌های ساختاری دارند. این یافته‌ها با هم، الگوی جدیدی را ایجاد می‌کنند که در آن کاتالیز از طریق ارتباطات چندوجهی همراه با دینامیک مجموعه‌های ساختاری RNA-Mg 2+ تنظیم می‌شود، نه یک ساختار کاتالیزوری استاتیک در یک حالت عمل واحد.

ساختار و دینامیک RNA برای عملکرد آن بسیار مهم است. علیرغم چندین دهه توسعه در زیست شناسی ساختاری، دینامیک ساختاری RNA و یون های Mg 2+ مرتبط با آن هرگز به طور مستقیم در وضوح نزدیک به اتم مشاهده نشده است. تکنیک‌های با وضوح بالا، مانند کریستالوگرافی اشعه ایکس و میکروسکوپ کریو الکترونی (cryo-EM)، تا حد زیادی بر تفکیک بیش از دینامیک، میانگین تعداد زیادی ذرات یا مولکول‌ها در شبکه‌ها، که اغلب در محیط‌های غیر فیزیولوژیکی Mg 2+ تثبیت می‌شوند، برای به دست آوردن یک ساختار اجماع واحد تأکید کرده‌اند.

رویکرد NMR تا حد زیادی به مدل‌های استنتاج احتمالی متکی است که اندازه‌گیری‌های 5، 6، 7 را برآورده می‌کنند. برعکس، روش‌های محاسباتی حرکات اتمی را با استفاده از میدان‌های نیرو که تقریبی باقی می‌مانند توصیف می‌کنند، به ویژه در مدل‌سازی برهمکنش‌های الکترواستاتیکی و هماهنگی Mg 2+ 8، 9. در نتیجه، مجموعه‌های ساختاری RNA و دینامیک یون‌های Mg2+ در شرایط یونی بومی آن حل نشده باقی می‌مانند.

تلاش‌های اخیر برای تجسم ناهمگونی RNA، از جمله میکروسکوپ نیروی اتمی همراه با یادگیری ماشین (AFM-HORNET) 10، 11، وسعت نمونه‌برداری ساختاری را نشان داده است، اما ساختارهای متمایز با یون‌های Mg2+ مرتبط، در حضور یا عدم حضور پروتئین‌های جانبی، در وضوح نزدیک به اتمی را نشان داده است. بنابراین، اساس ساختاری و رابطه مکانیکی بین دینامیک ساختاری همه اجزا و عملکردها یا فعالیت‌های آنها نامشخص است.

به طور خاص، Mg 2+، یک عامل تعیین کننده مرکزی چین‌خوردگی و کاتالیز RNA، تنها در زمینه ساختارهای استاتیک یا از طریق شبیه‌سازی‌های دینامیک مولکولی مورد مطالعه قرار گرفته است، و طبق دانش ما، مسیرهای دینامیکی آن در چارچوب‌های RNA انعطاف‌پذیر در غیاب و حضور فاکتورهای پروتئینی به‌طور تجربی نگاشت نشده است، بنابراین نقش‌های آن در RNA به صورت پویا یا پویا مطابق هستند.

Cryo-EM مخصوصا برای مجموعه‌های پروتئینی بزرگ با هسته ساختاری سفت و سخت بسیار مناسب است، اما همچنین نویدبخش کاوش دینامیک ساختاری 12، 13، 14، 15 است. با این وجود، توانایی کامل آن هنوز برای تعیین ساختار مناظر ساختاری RNA بسیار ناهمگن که حاوی کنفرم‌کننده‌های کم جمعیت اما از نظر عملکردی مهم هستند، نشان داده نشده است. باکتری Geobacillus stearothermophilus RNase P RNA (Gst RPR) نمونه ای از این مشکل است.

این یک مورد آزمایشی به خصوص آموزنده است، زیرا RNA خود بخش زیادی از داربست ساختاری را فراهم می کند. بر این اساس، شکل پذیری ساختاری حل شده در اینجا احتمالا منعکس کننده ویژگی های ذاتی داربست RNA است که در دودمان های دیگر با پروتئین محدودتر هستند. این یک دامنه اختصاصی (S-domain) (باقی مانده 87-249) و یک دامنه کاتالیزوری (C-domain) (باقی مانده 1-86 و 250-417) دارد.

اگر چه به خوبی تا شده است، بیش از 80٪ از باقی مانده های آن تحت غلظت فیزیولوژیکی Mg 2 + انعطاف پذیر باقی می ماند 11، و جفت مکانیکی بین نمونه برداری ساختاری آن، نقش Mg2 + و فعالیت کاتالیزوری ناشناخته باقی مانده است. این آنزیم RNA مسئول یک مرحله جهانی مورد نیاز در بلوغ tRNA است و بنابراین برای تمام زندگی ضروری است.

مطالعه قبلی ما ناهمگنی ساختاری گسترده ای از جزء این ریبوزیم را تحت غلظت های فیزیولوژیکی مرتبط Mg2+ نشان می دهد، اما اساس ساختاری ارتباط بیولوژیکی ناهمگنی و پروتئین rnpA بدون توصیف فضای ساختاری در وضوح نزدیک به اتمی کاملا مشخص نیست.

در اینجا نشان می‌دهیم که یک استراتژی cryo-EM متمرکز بر ناهمگنی می‌تواند بر برخی از چالش‌ها در تجسم مناظر ساختاری RNA ناهمگن، حل و فصل پویایی ساختار جزء ریبوزیم در حضور و عدم حضور rnpA در وضوح نزدیک اتمی، از جمله ساختارهای ساختاری و کاتالیزوری متعدد Mg2+، غلبه کند. استراتژی ما یک گردش کار عملی برای هدایت تجزیه و تحلیل داده‌های cryo-EM از مولکول‌های بسیار ناهمگن ایجاد می‌کند و اصول بیولوژیکی را نشان می‌دهد که پیچیده‌تر از مدل‌های اقدام ساده بر اساس عکس‌های فوری استاتیک ساختارها هستند.

بنابراین، مطالعه ما به عنوان یک کل چارچوبی برای تجسم دینامیک ساختاری RNA منعطف و یون‌های Mg 2 + مرتبط، و برای پل زدن پویایی و فعالیت ساختاری RNA فراهم می‌کند.

در تجزیه و تحلیل داده‌های cryo-EM، کاربرد قضیه برش فوریه به طور بحرانی به طبقه‌بندی دقیق پیش‌بینی‌ها به زیرگروه‌های همگن از نظر ساختاری و جهت‌گیری بستگی دارد. این به طور مستقیم تحت تأثیر نسبت ذاتی سیگنال به نویز پایین تصاویر کریو-EM از مولکول ها، و به خصوص مولکول های نسبتا کوچک توسط استانداردهای کرایو-EM قرار دارد، و تعیین اینکه آیا تغییر بین پیش بینی ها از تفاوت در ساختار یا جهت گیری ناشی می شود، دشوار است.

با استفاده از چارچوب شبیه‌سازی در مقیاس بزرگ خود، EMCrafter 18، نویز واقعی را شبیه‌سازی کردیم و تخمین تجربی حداقل تعداد ذرات مورد نیاز برای تعیین حجم سه‌بعدی در وضوح معین برای G. stearothermophilus RNase P (Gst RNase P) را بررسی کردیم (شکل ضمیمه داده‌ها 1 و Extended Data Fig. 1). در تنظیمات تجربی ما، ما تخمین می زنیم که حداقل 50000 ذره برای به دست آوردن حجمی با وضوح حدود 3 Å برای RNase P RNA مورد نیاز است، مشروط بر اینکه پشته های ذرات همگن باشند.

این عدد به عنوان مرجعی برای ارزیابی امکان‌سنجی و تخمین کل زمان مورد نیاز برای ثبت داده‌ها برای نگاشت فضای ساختاری ناهمگن Gst RNase P (روش‌های تکمیلی) مفید است.

برای تسهیل تجزیه و تحلیل داده‌های cryo-EM، یک گردش کار تکراری ایجاد کردیم که از تمرکز بر دستیابی به وضوح حداکثر با اولویت‌بندی جذب ناهمگنی فاصله می‌گیرد (داده‌های توسعه یافته شکل 2). پروتکل تجزیه و تحلیل ما شامل چهار مرحله است: پردازش داده، هرس ذرات، تعیین ناهمگنی، و پالایش سه بعدی، که در میان آنها تعیین ناهمگنی و تکرار آن با هرس ذرات حیاتی‌ترین روش‌ها هستند (روش‌های تکمیلی). در تعیین ناهمگنی، چهار مرحله فرعی وجود دارد (داده های توسعه یافته شکل 1).

2) با هدف شناسایی حالت های ساختاری اصلی موجود در مجموعه داده (داده های توسعه یافته شکل 2 و روش های تکمیلی). این مرحله از الگوریتم انتظار-بیشینه سازی با یک ماسک حلال کامل استفاده کرد که ناهمگونی وسیعی را در کل حجم ذرات نشان داد. ورودی با استفاده از پالایش محلی با ماسک کانونی اعمال شده روی هسته سفت و سخت ایجاد شد. در مرحله بعدی، تنوع ساختاری اضافی، به ویژه در مناطق پیرامونی، با استفاده از استراتژی‌های پوششی کانونی و حلال مورد بررسی قرار گرفت.

هنگامی که این رویکردها حجم‌هایی با تفکیک مناسب حاوی ذرات کافی برای طبقه‌بندی فرعی بیشتر تولید کردند، دورهای اضافی طبقه‌بندی سه بعدی برای شناسایی حالت‌های ساختاری متمایز انجام شد. اگر طبقه‌بندی فقط حجم‌های مشابهی تولید می‌کرد، پشته‌های ذرات ورودی به عنوان یک کلاس ساختاری واحد در نظر گرفته می‌شدند که سپس به عنوان مرجعی برای پالایش سه بعدی نهایی عمل می‌کرد. پشته های ذرات که حجم ناقصی را ارائه می کردند، معمولا به دلیل حرکت مداوم گسترده، برای طبقه بندی گسسته نامناسب در نظر گرفته می شدند.

این زیرمجموعه‌ها در عوض با استفاده از روش‌های ناهمگنی پیوسته، از جمله تجزیه و تحلیل تنوع 3DFlex 12 و 3D 17 (فیلم‌های تکمیلی 1 و 2) تجزیه و تحلیل شدند. در مرحله نهایی، پشته های ذرات همگن حل شده مجددا به اندازه پیکسل اسمی (0.732 Å در هر پیکسل) برش داده شدند. تصحیح حرکت مبتنی بر مرجع و/یا پالایش غیریکنواخت در CryoSPARC 12 برای به حداکثر رساندن وضوح حجم نهایی انجام شد. جزئیات بیشتر در مورد این تحلیل ها در روش های تکمیلی ارائه شده است.

ما 55 و 21 حجم مجزا از Gst RPR را به ترتیب در حالت های apo و holo تعیین کردیم (شکل 1a،b، داده های توسعه یافته شکل 3 و 4 و جدول تکمیلی 1). حجم‌های منفرد در وضوح جهانی حدود 3 A به خوبی تعریف می‌شوند، همانطور که توسط همبستگی پوسته فوریه استاندارد طلا در معیار 0.143 تخمین زده می‌شود، با وضوح متوسط ​​زیر 2.6 Å برای هسته و 5 A برای مناطق پیرامونی (شکل 1c).

76 جلد را می توان به طور کلی به عنوان دو کلاس اصلی کانفورمر بر اساس عدم وجود (باز) یا حضور (بسته) تعامل گیرنده تترالوپ-تتراحلقه (TL-TLR) که شامل P10.1 و P12 در دامنه S است، توصیف کرد. ناهمگونی ساختاری در هر دو حالت آپو و هولو در حجم های روی هم قرار داده شده آشکار می شود (شکل 1d). علاوه بر این، دامنه S، متشکل از P9، P10.1، و P12، همچنین حرکات پیوسته را در هر دو حالت apo و holo نشان می‌دهد، همانطور که توسط تجزیه و تحلیل با استفاده از 3DFlex در CryoSPARC نشان داده شده است (شکل 1e و ویدیوی تکمیلی 1).

a، b، حجم‌های cryo-EM منفرد از apo (a؛ 55 جلد؛ قرمز) و holo (b؛ 21 جلد؛ فیروزه‌ای) منطبق با پروتئین rnpA که در سرخابی نشان داده شده است. ولوم ها در 7 σ نمایش داده می شوند. عناصر ساختاری P10 و P12 را می توان مشاهده کرد که هر دو ترکیب بسته و باز را در هر دو حالت apo و holo اتخاذ می کنند. ج، نقشه‌های وضوح محلی برای حجم‌های معرف apo (بالا) و holo (پایین)، هر کدام با وضوح متوسط ​​حدود 3 Å. d، روی هم قرار دادن 15 جلد انتخابی آپو (بالا) و هولو (پایین)، که ناهمگونی ساختاری را نشان می دهد.

e، حرکات پیوسته مشاهده شده برای مناطق انعطاف پذیر (P9، P10، P12 و P19) در میان conformers apo (بالا) و holo (پایین)، با استفاده از 3DFlex (فیلم تکمیلی 1) تجزیه و تحلیل شد.

417 نوکلئوتیدی Gst RPR از بیش از پانزده عنصر ساختاری تشکیل شده است (شکل 2a) و می تواند ترکیبات متعددی را در هر دو حالت آپو و هولو اتخاذ کند (شکل 2b،c، روش های تکمیلی و جدول تکمیلی 1). ناهمگونی ساختاری، به ویژه در عناصر ساختاری محیطی، از جمله P1، P19 و L15 در دامنه C و P9، P10.1 و P12 در دامنه S، به راحتی قابل مشاهده است.

مقایسه ماتریس شباهت حرکت اتمی (AMSM)، که نشان‌دهنده همبستگی‌های حرکت هماهنگ عناصر ساختاری مشتق‌شده از داده‌های cryo-EM و آنهایی از رویکرد AFM-HORNET است، همبستگی ماتریس‌های 0.897 را نشان می‌دهد (شکل 2d,e)، که شباهت قابل‌توجهی را نشان می‌دهد که از رویکردهای دو ضلعی مشتق شده است. با این وجود، تفاوت عمده بین دو نقشه همبستگی در P19 نهفته است، با مدل‌های AFM-HORNET که نشان می‌دهد P19 همبستگی حرکتی کمتری را با P10.1 و P12 نسبت به مدل‌های cryo-EM نشان می‌دهد (شکل 2f).

این تفاوت به دلیل وضوح بالاتر حجم‌های cryo-EM است، که توسط آن می‌توان انطباق‌های گسسته با حرکات مرتبط نسبتا ظریف، مانند P19 با P10.1 و P12 را شناسایی کرد. در مقابل، رویکرد AFM-HORNET منطبق‌کننده‌های آشکارا متمایز با دامنه‌های بزرگ را انتخاب می‌کند، که بیشتر از دامنه‌های نسبتا کوچک است، گویی که حرکات کوچک همبستگی ندارند.

بنابراین cryo-EM ساختارهایی از conformerهای غالب را در وضوح نزدیک به اتمی ارائه می دهد، در حالی که AFM-HORNET با گرفتن حالت های ساختاری نادری که در روش cryo-EM میانگین می شوند، فضای ساختاری وسیع تری را به تصویر می کشد.

a، چیدمان سازه ثانویه با عناصر ساختاری با کد رنگی مانند مدل های سه بعدی در b، c. b، c، ساختارهای conformer apo (b؛ n = 55) و holo (c؛ n = 21) به ترتیب در نمودارهای نواری ارائه شده‌اند. پروتئین rnpA نیز با یک سطح شفاف نشان داده شده است. d، e، مقایسه AMSM ساختارهای مشتق شده از داده های apo cryo-EM (d) و آنهایی که از AFM-HORNET (e)، با همبستگی پیرسون r = 0.897. حرکت همبسته از قرمز (همبستگی قوی) تا آبی (ضد همبستگی) رنگی است. f ، ماتریس تفاوت d و e (HORNET – apo).

نواحی آبی در مدل‌های آپو همبستگی قوی‌تری دارند و نواحی قرمز در مدل‌های HORNET همبستگی قوی‌تری دارند. g , AMSM مدل های holo. h، ماتریس تفاوت g و d (holo – apo)، که در آن نواحی قرمز در مدل‌های holo و نواحی آبی در مدل‌های apo همبستگی قوی‌تری دارند. i، همبستگی پیرسون (r) بین میانگین RMSF برای هر باقیمانده برای مدل‌های ساختاری cryo-EM apo و holo. باقی مانده های IDTM قرمز رنگ می شوند. j، مقایسه RMSD پسماند مدل‌های ساختاری apo، holo و HORNET. سایه خاکستری نشان دهنده s.d.

برای مدل های HORNET k، میانگین RMSD جفتی جایگشتی به ازای هر باقیمانده بین apo و holo conformers، با s.d. به رنگ خاکستری l، جابجایی پر نوکلئوتید در میان کانفورمرهای apo (n = 55) و holo (n = 21) که به‌عنوان نمودارهای ویولن برای عناصر ساختاری انعطاف‌پذیر ترسیم شده‌اند. کادر داخلی محدوده بین چارکی را نشان می دهد (IQR (صدک 25 تا 75))، سبیل ها تا شدیدترین مقادیر در 1.5 × IQR گسترش می یابند، و نقطه سفید نشان دهنده میانه است. پانل های e , j از ref. 11 , CC BY 4.0 .

تجزیه و تحلیل holo AMSM (شکل 2g) یک الگوی همبستگی تقریبا مشابه با حالت آپو را نشان می دهد، با همبستگی پیرسون 0.96 (شکل 2d,g). با این وجود، تفاوت AMSM بین مدل‌های holo و apo نشان می‌دهد که بیشتر عناصر ساختاری به طور کلی در مدل‌های holo، که با قرمز و نارنجی نشان داده شده‌اند، نسبت به مدل‌های apo در مدل‌های apo همبستگی بیشتری دارند (شکل 2h). با این حال، دو ناحیه کوچک آبی تیره بین P10.1-P12 در دامنه S و P19 در دامنه C با اتصال rnpA کمتر با حرکت ارتباط دارند (شکل 2h، خطوط نقطه چین).

تجزیه و تحلیل بیشتر با استفاده از همبستگی ریشه میانگین مربعات نوسانات (RMSF) بین گروه آپو و هولو، رفتار واگرای باقیمانده‌ها در P12 را نشان می‌دهد، که عمدتا شامل مواردی است که در موتیف حلقه T درهم (IDTM) 19، در مقایسه با باقیمانده‌های دیگر (شکل 2i، تغییر معنی‌دار در شکل دوتایی rTMA) را شامل می‌شود.

سپس دامنه حرکت عناصر ساختاری مختلف را بررسی کردیم. میانگین جفتی انحراف ریشه میانگین مربع (RMSD) به ازای هر باقیمانده در conformers apo و holo توسط cryo-EM یک الگوی حرکت کلی شبیه به آنچه با استفاده از AFM-HORNET 11 بدست می‌آید (شکل 2j) نشان می‌دهد، با RMSD مشاهده شده توسط cryo-EM به اندازه 30 Åain S-domain. با این حال، این دامنه بسیار کوچکتر از آن است که توسط AFM-HORNET مشاهده شده است. تفاوت در دامنه، تمایز اساسی بین این دو تکنیک را به همان دلیلی که در بخش قبل توضیح داده شد، منعکس می کند.

مهمتر از همه، هم کریو-EM و هم AFM-HORNET نشان می‌دهند که یکی از بزرگترین حرکات شامل P10.1 و P12 است. علاوه بر این، بزرگترین تغییر دامنه مشاهده شده در نمودارهای RMSD به ازای هر باقیمانده به طور میانگین در تمام جفت‌های جایگشت بین conformers در گروه‌های apo و holo cryo-EM نیز شامل P10.1 و P12 است، جایی که IDTM در آن قرار دارد (شکل 2j-l).

تجزیه و تحلیل جزئی اجزای اصلی کانفورمرهای cryo-EM نشان می‌دهد که اتصال rnpA ترتیبات، جهت‌های حرکت و توزیع‌ها را در چهار مولفه حرکت اصلی که این دو عنصر ساختاری محیطی را علاوه بر سایرین شامل می‌شود، تغییر می‌دهد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5، ویدئوهای تکمیلی 3 و 4 و شکل 17 مکمل). IDTM یک عنصر ساختاری عمومی است و نقش مهمی در تشخیص RNA-RNA دارد. با این حال، رابطه هم افزایی بین P12 و P10.1 مشخص نیست.

به نظر می رسد با هم، اتصال rnpA یک اثر آلوستریک اعمال می کند که منجر به بازسازی دیستال مناطق P12 و P10.1 می شود. با این حال، قبل از ایجاد این رابطه علی، تعیین اینکه آیا اتصال rnpA همچنین منجر به بازسازی ساختاری محل‌های اتصال و کاتالیزوری می‌شود، ضروری است. نشان داده شده است که جزء RNase P RNA مسئول کاتالیز در غلظت های غیر فیزیولوژیکی Mg 2+ 20 است.

با این حال، این سوال که آیا RNase P دارای یک ساختار کاتالیزوری از پیش ساخته شده در بین همه conformers تحت غلظت 1 میلی‌مولار Mg2+، مستقل از حضور کوفاکتور پروتئین یا سوبسترا است، نامشخص است.

تجزیه و تحلیل‌های با وضوح پایین قبلی ما یک منطقه ساختاری ثابت (IR) را شناسایی کرد که هم مرکز کاتالیزوری و هم محل اتصال rnpA را در بر می‌گرفت. با این وجود، برخی شواهد تجربی نشان می‌دهند که در غیاب rnpA، محل فعال ممکن است فقط تا حدی مرتب شود، با یون‌های ساختاری Mg 2+ چین‌های RNA را تثبیت می‌کنند اما هندسه کاتالیزوری را ناقص می‌گذارند 21، 22. در مطالعه حاضر، با میانگین Q-score بیش از 0.7 (شکل های تکمیلی 12 و 13) و وضوح محلی تقریبا 2.3 Å (شکل های تکمیلی.

20 و 21، ساختارهای IR به خوبی در هر دو apo (شکل 3a,b) و holo conformers (شکل 3c,d) مشخص هستند. حجم کلی IR بدون توجه به حضور rnpA (شکل 3b,d-f) در همه کانفورمرهای قابل تشخیص در وضوح فعلی (تصویر تکمیلی 23) تغییر کمی می کند. میانگین همبستگی بین حجم های کنفورمر در هر دو گروه آپو و هولو از 0.93 فراتر می رود (شکل 3b،d)، و ساختارهای IR در هر مجموعه با نوسانات ریشه میانگین مربع در 0.6 Å روی هم قرار می گیرند. علاوه بر این، ساختارهای IR کانفورمرهای آپو و هولو در هنگام برهم نهی تقریبا یکسان هستند (شکل 2).

3g,h)، از یک معماری کاتالیزوری از پیش ساخته شده و یک حالت قفل و کلید تعامل بین rnpA و Gst RPR پشتیبانی می کند. قابل ذکر است، در حضور rnpA، برهمکنش انباشته پایه بین A334 و G335 رفتار پایدارتری نسبت به غیاب آن نشان می‌دهد. این نتایج بر نقش اصلی Gst RPR در ساختار و کاتالیز، مشابه آنزیم‌های پروتئینی تأکید می‌کند. بنابراین به نظر می رسد که IR سفت و سخت حتی در غیاب rnpA از نظر کاتالیزوری آماده است، مطابق با یافته قبلی ما 11 .

این سفتی محل‌های اتصال کاتالیزوری و rnpA شبیه آنزیم‌های پروتئینی 23 است، که کاملا در تضاد با نظم و شکل‌پذیری ساختاری ناشی از لیگاند در بسیاری از ریبوزیم‌های فعال سیس 24 است. بنابراین، افزایش فعالیت توسط rnpA از بازسازی ساختاری در سایت‌های کاتالیزوری یا اتصال rnpA ناشی نمی‌شود.