CD51 زیرگروه‌های آستروسیتی از نظر عملکردی متمایز را در مدارهای عصبی مشخص می‌کند

آستروسیت‌ها طیف متنوعی از وظایف را انجام می‌دهند که فیزیولوژی مغز را تسهیل می‌کند و این احتمال را افزایش می‌دهد که این نقش‌های آستروسیتی متنوع توسط زیرگروه‌های عملکردی متمایز 1، 2 فعال شوند. مطالعات اخیر تنوع مولکولی را در بین آستروسیت ها شناسایی کرده است. با این حال، اینکه آیا این ناهمگونی مولکولی نشان‌دهنده زیرجمعیت‌های آستروسیتی تخصصی با عملکردهای متمایز است، هنوز مشخص نیست.

در اینجا، بر اساس مطالعات مولکولی و عملکردی قبلی 4، ما یک خط موش CD51-FLP را ایجاد کردیم که امکان مقایسه مستقیم ویژگی‌های عملکردی بین زیرجمعیت‌های آستروسیت CD51 + و CD51- را در مدارهای عصبی در داخل بدن فراهم می‌کند. ما نشان می‌دهیم که آستروسیت‌های CD51 + و CD51- خواص مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و رشدی منحصر به فردی در قشر و هیپوکامپ دارند. مطالعات عملکردی نشان می‌دهد که آستروسیت‌های CD51 + به طور انتخابی تشکیل سیناپس را در قشر در حال توسعه و شکل‌پذیری مدار در هیپوکامپ ترویج می‌کنند.

از نظر مکانیکی، ما دریافتیم که آستروسیت‌های CD51 + از طریق گلایپیکان 6 برای تقویت تشکیل سیناپس در قشر مغز عمل می‌کنند، در حالی که CD51 خود باعث شکل‌پذیری مدار در هیپوکامپ می‌شود. با استفاده از این یافته‌ها برای آسیب مغزی، متوجه شدیم که آستروسیت‌های CD51 + بهبود عملکردی پس از سکته را از طریق بازسازی سیناپسی افزایش می‌دهند. در مجموع، مطالعات ما زیرجمعیت‌های آستروسیتی را شناسایی می‌کنند که ویژگی‌های عملکردی مشخصی را در مغز در حال رشد، بالغ و آسیب دیده نشان می‌دهند.

تنوع سلولی یک ضرورت عملیاتی برای همه سیستم‌های اندام است که در آن انواع سلول‌های مختلف در تقسیم کار شرکت می‌کنند که فعالیت‌های فیزیولوژیکی ضروری را تنظیم می‌کند. آستروسیت ها فراوان ترین نوع سلول های گلیال در سیستم عصبی مرکزی (CNS) هستند و نقش های حیاتی در تمام جنبه های فیزیولوژی مغز، از جمله انتقال عصبی، سیناپتوژنز، عملکرد مدار، پشتیبانی متابولیک و حفظ سد خونی مغزی، همراه با پاسخ به آسیب و انحطاط دارند.

پیشرفت‌ها در فن‌آوری‌های توالی‌یابی RNA تک سلولی (scRNA-seq) شناسایی چندین زیرجمعیت آستروسیتی آینده‌نگر را تسهیل کرده است، و نشان می‌دهد که این نقش‌های متنوع ممکن است توسط زیرمجموعه‌هایی از آستروسیت‌های مجزا انجام شود. با این حال، اینکه آیا آستروسیت‌های تخصصی قادر به اجرای زیرمجموعه‌ای از این توابع متنوع هستند یا خیر، هنوز خیلی ضعیف تعریف شده است، زیرا بررسی تجربی میزان ناهمگونی مولکولی که تا چه حد زیرگروه‌های عملکردی متمایز آستروسیت‌ها را در مدارهای عصبی فعال منعکس می‌کند، همچنان یک چالش بزرگ است.

در حالی که چندین مطالعه قبلی جمعیت آستروسیت‌هایی را شناسایی کردند که نشانگرهای منحصربه‌فردی را بیان می‌کردند و نقش این ژن‌های خاص در آستروسیت‌ها را در زمینه مدارهای عصبی نشان دادند، هنوز مشخص نیست که آیا این جمعیت‌ها ویژگی‌های عملکردی منحصربه‌فردی دارند یا خیر. نمایش بدون ابهام از زیرجمعیت‌های آستروسیتی از نظر عملکردی متمایز در سطح سلولی مستلزم مقایسه مستقیم ویژگی‌های عملکردی بین دو جمعیت در داخل بدن است.

به طور بحرانی، ابزارهایی که برچسب‌گذاری انتخابی و دستکاری زیرمجموعه‌های تعریف‌شده آستروسیت‌ها را ممکن می‌سازد، که مقایسه مستقیم بین زیرجمعیت‌های مختلف آستروسیت‌ها را تسهیل می‌کند، وجود ندارند. بنابراین، اینکه آیا زیرگروه های متمایز از آستروسیت ها در مدارهای عصبی وجود دارند یا خیر، حل نشده باقی مانده است. در اینجا ما آستروسیت‌های CD51 + و CD51- را به عنوان زیرجمعیت‌هایی با ویژگی‌های متمایز و عملکردهای متنوع در تنظیم مدارهای عصبی در سراسر رشد قشر پس از تولد، یادگیری و حافظه و ترمیم مغز شناسایی می‌کنیم.

با استفاده از رویکردهای مبتنی بر مرتب‌سازی سلولی فعال‌شده با فلورسانس (FACS) در مغز موش بالغ، مطالعات قبلی ما CD51، زیرواحد اینتگرین αV کدگذاری‌شده توسط Itgav را به‌عنوان نشانگر سطح سلولی که قادر به تقسیم زیر مجموعه‌های آستروسیت‌ها با خواص مولکولی منحصربه‌فرد است، شناسایی کرد. اینکه آیا آستروسیت های بیان کننده CD51 دارای خواص منحصر به فردی در داخل بدن در مدارهای عصبی فعال هستند، نامشخص است. بنابراین ما یک خط موش تولید کردیم که هدف گیری انتخابی آستروسیت های CD51 + در مغز موش را امکان پذیر می کند.

برای دستیابی به این هدف، ما یک خط موش CD51-FLP BAC (کروموزوم مصنوعی باکتریایی) را مهندسی کردیم و خط موسس CD51-FLP را با موش های Rosa-FSF-tdTomato (که در آن FSF نشان دهنده FRT-stop-FRT است) تلاقی دادیم، به طوری که گزارشگر در حضور فعالیت FLP5tsaFP; (شکل 1a). تجزیه و تحلیل این خط موش بیان پروتئین CD51 را در سلول‌های بیانگر td گوجه‌فرنگی نشان داد، که نشان‌دهنده هدف‌گیری موفقیت‌آمیز این جمعیت است (داده‌های توسعه یافته شکل 1c-e).

بیان گوجه فرنگی در زیرمجموعه ای از سلول های اندوتلیال نیز مشهود بود، اما به ندرت در سایر انواع سلول ها (داده های توسعه یافته شکل 2a,b). نکته مهم، بیان tdTomato در آستروسیت ها با واکنش ایمنی به آنتی بادی ضد CD51 بسیار مطابقت داشت (داده های توسعه یافته شکل های 1c-e و 2c,d). برای ارزیابی میزان هدف قرار دادن خط CD51-FLP; Rosa-FSF-tdTomato، آستروسیت‌ها در مغز موش‌های 8 هفته‌ای، ما نشانگر پان آستروسیت SOX9 را رنگ آمیزی کردیم و ترکیب CD51 + (tdTomato + SOX9 + -t -t SOX9Tomatos در سراسر) و SOX9 + -t CD51 را ارزیابی کردیم. مجموعه ای از نواحی مغز (شکل.

1b,c و داده های توسعه یافته شکل 1a,b). این تجزیه و تحلیل حضور آستروسیت‌های CD51 + و CD51- را در نسبت‌های مختلف در سراسر مغز نشان داد، با آستروسیت‌های CD51 + تقریبا 19 درصد از آستروسیت‌های هیپوکامپ، 13 درصد از آستروسیت‌های حباب بویایی و 38 درصد از آستروسیت‌های قشر مغز را نشان می‌دهند (شکل 1c). قابل توجه، یافته ما مبنی بر اینکه 19 درصد از آستروسیت ها در هیپوکامپ CD51 + هستند با داده های scRNA-seq در دسترس عموم از هیپوکامپ 11 موش بالغ مطابقت دارد (داده های توسعه یافته شکل 1f).

این داده ها نشان می دهد که موش CD51-FLP می تواند آستروسیت های CD51 + و CD51- را در مغز بالغ تشخیص دهد.

الف، شماتیک شناسایی آستروسیت های CD51 +. ب، تصاویر نمایانگر پهن (بالا) و هم کانونی (پایین) برچسب‌گذاری tdTomato و آستروسیت‌های CD51 + و CD51 - در موش‌های CD51-Flp؛ Rosa-CAG-FSF-tdTomato. CB، مخچه؛ CSC، نخاع گردن؛ HB، مغز عقبی؛ HPC، هیپوکامپ؛ HY، هیپوتالاموس؛ MCX، قشر حرکتی؛ OB، لامپ بویایی؛ SCX، قشر حسی تنی؛ STR، مخطط؛ TH، تالاموس; VCX، قشر بینایی. ج، نسبت آستروسیت‌های CD51 + و CD51- در 12 ناحیه CNS از n = 5 موش. d، شماتیک برچسب گذاری متقاطع آستروسیت های CD51 + و CD51-.

e، تصاویری از زیرجمعیت‌های آستروسیت در قشر و هیپوکامپ. f، تجزیه و تحلیل Sholl آستروسیت های CD51 + و CD51 - در قشر (بالا) و هیپوکامپ (پایین). قشر: n = 145 CD51 + آستروسیت، 150 CD51 - آستروسیت، n = 3 موش در هر گروه. هیپوکامپ: n = 129 CD51 + آستروسیت، 290 CD51 - آستروسیت، n = 4 موش در هر گروه. اثر اصلی گروه تحلیل واریانس دو طرفه (ANOVA). **** P < 0.0001. g، شماتیک بیان GCaMP6 در آستروسیت ها. h – k، تجزیه و تحلیل فعالیت کلسیم در قشر (h، i) و هیپوکامپ (j، k).

نشان‌دهنده آثاری از آستروسیت‌های منفرد (h، j) و کمی‌سازی سیگنال‌دهی کلسیم نشان داده شده است (i، k). قشر: n = 13 CD51 + آستروسیت، 12 CD51 - آستروسیت. هیپوکامپ: n = 19 CD51 + آستروسیت، 18 CD51 - آستروسیت. n = 3 موش در هر منطقه در هر زیرجمعیت. آزمون t دو طرفه; قشر: P = 0.0079 (AUC)، P = 0.2296 (فرکانس) و P = 0.0083 (دامنه). هیپوکامپ: P = 0.00667 (AUC)، P = 0.00822 (فرکانس) و P = 0.00066 (دامنه). l، جدول زمانی پالس EdU و تصاویر نماینده قشر در سراسر رشد پس از تولد در موش های CD51-Flp؛ Rosa-CAG-FSF-tdTomato.

نماینده چهار موش در هر نقطه زمانی. m، تصاویر نماینده برچسب گذاری EdU در P7. فلش ها CD51 + EdU + SOX9 + آستروسیت ها را نشان می دهند. نماینده چهار موش در هر نقطه زمانی. n، کمیت سلول های tdTomato + در بین آستروسیت های SOX9 + در طول رشد قشر از n = 4 موش در هر نقطه زمانی. o، کمیت نسبت EdU + هر زیرجمعیت آستروسیت در قشر مغز. n = 4 موش در هر نقطه زمانی. آزمون t دو دم; مقادیر دقیق P به شرح زیر بود: P1: ** P = 0.00222; P7: *** P = 0.00018; P14: *** P = 0.00016; P21: P = 0.05061; P28: P = 0.13638.

داده ها میانگین ± s.e.m هستند. (c، f، n و o)، و نمودارهای کادر در i و k، میانه (خط مرکزی) و چارک ها (حدود جعبه) را نشان می دهند، و سبیل ها مقادیر حداقل و حداکثر را نشان می دهند. نمودارهای a، d و g با استفاده از BioRender ایجاد شدند. دنین، بی. https://BioRender.com/um5vopg (2026). میله های مقیاس، 10 میکرومتر (b، e)، 50 میکرومتر (m) و 200 میکرومتر (l).

ما در مرحله بعد به دنبال ارزیابی خواص سلولی جمعیت آستروسیت CD51 + و CD51- در قشر و هیپوکامپ، با تمرکز بر مورفولوژی سلولی و فعالیت Ca2+ بودیم. خط موش CD51-FLP به ما اجازه می دهد تا از سیستم FLP-FRT برای بیان مشروط گزارشگران با استفاده از رویکردهای ویروسی متقاطع در آستروسیت های CD51 + یا CD51 - استفاده کنیم 12، 13. با ترکیب این ابزارهای ویروسی مبتنی بر FLP با ماوس CD51-FLP، می‌توانیم زیرجمعیت‌های آستروسیت CD51 + و CD51 - را با tdTomato برچسب‌گذاری کنیم (شکل 1d).

بر این اساس، ما قشر یا هیپوکامپ موش‌های CD51-FLP 4 هفته‌ای را تزریق کردیم، بافت موش را در 8 هفتگی جمع‌آوری کردیم و بیان گزارشگر شرطی tdTomato را ارزیابی کردیم. با استفاده از گزارشگر tdTomato برای ارزیابی مورفولوژی، دریافتیم که آستروسیت‌های CD51 + در قشر در مقایسه با آستروسیت‌های CD51- پیچیدگی مورفولوژیکی افزایش یافته‌ای را نشان می‌دهند. در مقابل، آستروسیت های CD51 + در هیپوکامپ پیچیدگی نسبتا کاهش یافته ای را نشان دادند (شکل 1e,f).

با استفاده از رویکردهای مشابه، ما ویروس‌های مرتبط با آدنو مشروط (AAVs) را تولید کردیم که ما را قادر می‌سازند به طور انتخابی آستروسیت‌های CD51 + و CD51 - را با GCaMP6، یک حسگر نوری که به طور قابل اعتماد فعالیت 14 Ca2+ را گزارش می‌کند، هدف قرار دهیم (شکل 1g). با استفاده از جریان کاری مشابهی که در بالا توضیح داده شد، از تصویربرداری دو فوتونی برای اندازه‌گیری فعالیت Ca 2+ در برش‌های ex vivo از قشر یا هیپوکامپ استفاده کردیم و دریافتیم که CD51 + آستروسیت‌های موجود در قشر در مقایسه با آستروسیت‌های CD51-، فعالیت خود به خودی Ca2 را افزایش می‌دهند (شکل 1h,i).

در مقابل، در هیپوکامپ، آستروسیت های CD51- فعالیت خود به خودی Ca2+ در مقایسه با آستروسیت های CD51 + نشان دادند (شکل 1j,k). با هم، این مطالعات نشان می دهد که آستروسیت های CD51 + و CD51- دارای خواص مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی منحصر به فردی در داخل و در سراسر قشر و هیپوکامپ هستند.

شناسایی ویژگی‌های منحصربه‌فرد آستروسیت‌های CD51 + و CD51- در مغز بزرگسالان ما را بر آن داشت تا بررسی کنیم که آیا آنها همچنین ویژگی‌های رشدی منحصربه‌فردی مانند تکثیر و زمان‌بندی گسترش را نشان می‌دهند یا خیر. استفاده از رشد قشر پس از تولد به عنوان یک مدل، در ارتباط با CD51-FLP. خط موش Rosa-FSF-tdTomato، ما ترکیب آستروسیت‌های CD51 + و CD51- را در طول روز 1 (P1) تا P28 پس از تولد ارزیابی کردیم، زمانی که آستروسیتوژنز در قشر 15، 16، 17 رخ می‌دهد.

این تجزیه و تحلیل افزایش ثابتی را در نسبت CD51 + آستروسیت بین P1 و P21 نشان داد، با تعداد نسبی آستروسیت tdTomato + SOX9 + در حدود 40٪ توسط P21 (شکل 1l-n). این یافته در سراسر لایه های قشر منفرد حفظ شد (داده های توسعه یافته شکل 2e). این مشاهدات نشان می‌دهد که سلول‌های CD51 + در طول این بازه تحت یک انبساط پرولیفراتیو قرار می‌گیرند. با توجه به اینکه حدود 50 درصد از آستروسیت های قشر مغز توسط تکثیر موضعی در خارج از نواحی ژرمینال و در پارانشیم مغز بین P1 و P21 ایجاد می شوند.

15، 16، 18)، در مرحله بعد نرخ تکثیر نسبی این جمعیت ها را ارزیابی کردیم. با استفاده از روش‌های برچسب‌گذاری EdU (شکل 1l)، دریافتیم که آستروسیت‌های CD51- در P1 به شدت تکثیر می‌شوند، که با افزایش تکثیر CD51 + آستروسیت‌ها در P7-21 (شکل 1m-o) دنبال می‌شود. رنگ آمیزی ایمنی برای نشانگرهای چرخه سلولی Ki-67 و هیستون فسفریله H3 همان الگوی نتایج را به همراه داشت (داده های توسعه یافته شکل 2f-k).

این داده‌ها با مشاهده ما از افزایش تعداد آستروسیت‌های CD51 + در طول این بازه زمانی مطابقت دارند، که نشان می‌دهد آستروسیت‌های CD51 + در طول بازه P1-21 در پارانشیم مغز تکثیر و گسترش می‌یابند. در مقابل، به نظر می‌رسد آستروسیت‌های CD51- عمدتا در مراحل اولیه رشد تولید می‌شوند و ظرفیت تکثیر کمتری را در مراحل بعدی فاصله P1-21 نشان می‌دهند.

ما بعدا به دنبال درک منشأ آستروسیت‌های CD51 + بودیم. تجزیه و تحلیل داده‌های RNA-seq آستروسیت در حال توسعه 19 نشان داد که بیان Itgav پس از تولد در سلول‌های اصل و نسب آستروسیت ظاهر می‌شود (داده‌های توسعه یافته شکل 3a). به همین ترتیب، با استفاده از CD51-FLP. موش Rosa-FSF-tdTomato، ما متوجه شدیم که پیش سازهای SOX2 + در ناحیه بطنی/زیر بطنی، tdTomato (CD51) را در شروع گلیوژنز قشر مغز در روز جنینی 16.5 (E16.5) بیان نمی کنند، اما یک زیر مجموعه tdTomato end در P1-Ext مثبت بود.

این داده ها نشان می دهد که آستروسیت های CD51 + پس از شروع گلیوژنز مشخص می شوند. به طور قابل‌توجهی، ما موتیف‌های اتصال فاکتور هسته‌ای فاکتور رونویسی رشد گلیال I-A (NFIA) را در نواحی تنظیم‌کننده بالادست Itgav شناسایی کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3g)، که نشان می‌دهد NFIA می‌تواند در تنظیم بیان CD51 و تشکیل آستروسیت‌های CD51 + نقش داشته باشد. برای آزمایش این، ما موش‌های Aldh1l1-creER;NFIA-flox;Rosa-LSL-tdTomato را تولید کردیم که حذف Nfia ناشی از تاموکسیفن و بیان tdTomato را در آستروسیت‌ها فعال کرد (از این پس ناک اوت شرطی Nfia (cKO)؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل.

3 ساعت). موش های Aldh1l1-creER; Rosa-LSL-tdTomato به عنوان شاهد استفاده شدند. ما تاموکسیفن را در 24 ساعت پس از تولد به نوزادان تزریق کردیم، زمانی که تعداد نسبتا کمی آستروسیت +CD51 در قشر مغز وجود دارد (شکل 1n). در P28، ما متوجه شدیم که موش‌های Nfia -cKO نسبت به میزان قابل‌توجهی از آستروسیت‌های CD51 + در قشر مغز در مقایسه با موش‌های کنترل داشتند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3h-l)، که نشان می‌دهد NFIA رشد آستروسیت‌های CD51 + را تنظیم می‌کند.

رشد آستروسیت پس از تولد تا حدی توسط نشانه های بیرونی از طریق مکانیسم های وابسته به فعالیت عصبی تنظیم می شود 20، 21. برای آزمایش اینکه آیا فعالیت نورونی بر نسبت آستروسیت‌های CD51 + یا CD51- تأثیر می‌گذارد، از Gq -DREADD (گیرنده‌های طراح که منحصرا توسط داروهای طراح فعال می‌شوند) تحریک نورون‌های تحریک‌کننده قشر مغز از P7-21 که از مطالعه قبلی ما اقتباس شده بود (21) استفاده کردیم. با این حال، ما دریافتیم که این دستکاری بر نسبت آستروسیت هایی که CD51 + یا CD51 - بودند تأثیری نداشت.

بنابراین، به نظر می‌رسد که منشأ جمعیت‌های آستروسیت CD51 + و CD51- که ما شناسایی کرده‌ایم، عمدتا به برنامه‌های ژنتیکی ذاتی سلولی وابسته است تا فعالیت عصبی.

پس از دریافت که آستروسیت‌های CD51 + و CD51- خواص منحصر به فردی از خود نشان می‌دهند، سپس بررسی کردیم که آیا این جمعیت‌ها پروفایل‌های مولکولی مجزایی را نشان می‌دهند یا خیر. برای رسیدن به این هدف، ما CD51-FLP را با هم تلاقی کردیم. خط Rosa-FSF-tdTomato با خط ماوس Aldh1l1-GFP (شکل 2a). این رویکرد ما را قادر ساخت تا آستروسیت‌های CD51 + (GFP + tdTomato + ) و CD51 - (GFP + tdTomato -) را از قشر و هیپوکامپ موش‌های 8 هفته‌ای جدا کرده و تجزیه و تحلیل transcriptomic را با استفاده از RNA-seq انجام دهیم.

تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک نشان داد که جمعیت های جدا شده CD51 + GFP + و CD51 - GFP + نشانه های مولکولی آستروسیت ها را نشان می دهند و پروفایل های transcriptomic را که از یکدیگر متمایز هستند نشان می دهند (داده های توسعه یافته شکل 4a-d,f و جدول تکمیلی 1). علاوه بر این، مقایسه با جمعیت آستروسیت های جدا شده از FACS در مطالعات قبلی ما 4 یک همبستگی قوی بین آستروسیت های CD51 + GFP + و جمعیت C را نشان داد که CD51 را نیز بیان می کند (داده های توسعه یافته شکل 4e).

در مرحله بعد، عبارات هستی شناسی ژن (GO) غنی شده در آستروسیت های CD51 + از قشر مغز را ارزیابی کردیم و ژن های مرتبط با عملکرد سیناپسی، مونتاژ سیناپس و تعامل با نورون های غنی شده در این جمعیت را یافتیم (شکل 2b،c و جدول تکمیلی 2). با توجه به اینکه آستروسیت‌ها نقش اساسی در تشکیل سیناپس دارند، سپس بیان ژن‌های سیناپتوژنیک شناخته شده را در آستروسیت‌های CD51 + و CD51- ارزیابی کردیم و بیان غنی‌شده اعضای خانواده گلایپیکان را در آستروسیت‌های CD51 + یافتیم (شکل 2d و داده‌های توسعه‌یافته شکل 5).

به طور خلاصه، این داده ها نشان می دهد که آستروسیت های CD51 + و CD51- ویژگی های مولکولی منحصر به فردی دارند.

a، شماتیک شناسایی آستروسیت های CD51 + و CD51- بر اساس بیان tdTomato و GFP متقاطع. ب، مقایسه بیان ژن بین آستروسیت های CD51 + و CD51-. مقادیر P تعدیل شده با استفاده از DeSeq2 (آزمون والد) محاسبه شد. c، اصطلاحات GO غنی شده در CD51 + آستروسیت های قشر مغز. مقادیر P با استفاده از آزمون دقیق فیشر دو طرفه محاسبه شد. d، بیان ژن های سیناپتوژنی شناخته شده بین آستروسیت های CD51 + و CD51-. e ، جدول زمانی آزمایشی. همه گروه‌ها بیان hM3D را در آستروسیت‌های CD51 + یا CD51- درگیر کردند. درمان با CNO یا سالین در پانل ها ذکر شده است.

f، شماتیک استفاده از AAVs برای فعال کردن آستروسیت‌های CD51 + و CD51-. g، تصویری از بیان hM3D-mCherry در آستروسیت‌های CD51-. نماینده 10 موش. h، تعیین کمیت بیان hM3D-mCherry در آستروسیت‌های SOX9 + برای هر زیرجمعیت. n = 10 موش در هر شرایط. i , تصاویر نماینده VGlut1 + PSD95 + سیناپس ها. j، کمی سازی چگالی سیناپس. آزمون های فیشر پس از آنالیز واریانس دوطرفه قابل توجه انجام شد. * P = 0.0178، **** P <0.0001. n = 7 (CD51 +، سالین)، 10 (CD51 +، CNO)، 6 (CD51 -، سالین) و 8 (CD51 -، CNO) موش.

k، ردیابی های نماینده ضبط شده از نورون های قشر مغز. l، کمی سازی جریان های پس سیناپسی تحریکی خود به خودی (sEPSCs) و جریان های پس سیناپسی مهاری خود به خودی (sIPSCs) در نورون ها. n = 11 (کنترل)، 13 (CD51 +) و 14 (CD51 - ). دامنه sEPSC (آمپر): ANOVA یک طرفه (F 2,37 = 0.1486؛ P = 0.8624). تست های توکی: P = 0.8496 (کنترل در مقابل CD51 +)، P = 0.9508 (کنترل در مقابل CD51 - )، P = 0.9576 (CD51 + در مقابل CD51 - ).

فرکانس sEPSC (فرکانس): ANOVA یک طرفه (F 2,37 = 8.185؛ P = 0.0011). تست های توکی: 0.0028 = P (کنترل در مقابل CD51 +)، 0.8825 = P (کنترل در مقابل CD51 - )، P = 0.0042 (CD51 + در مقابل CD51 - ). دامنه sIPSC: ANOVA یک طرفه (F 2,37 = 2.676؛ P = 0.0815). تست های توکی: 0.5583 = P (کنترل در مقابل CD51 +)، 0.4939 = P (کنترل در مقابل CD51 - )، P = 0.0658 (CD51 + در مقابل CD51 - ). فرکانس sIPSC: ANOVA یک طرفه (F 2,37 = 9.874؛ P = 0.0003). تست های توکی: P = 0.0067 (کنترل در مقابل CD51 +)، P = 0.7516 (کنترل در مقابل CD51 - )، P = 0.0004 (CD51 + در مقابل CD51 - ).

m، شماتیک AAVها و جدول زمانی. AAV هایی که sgRNA های هدفمند Gpc6 را کد می کنند از موش های کنترل حذف شدند. n، تصاویر نماینده VGlut1 + PSD95 + سیناپس های قشر مغز. o، کمی سازی چگالی سیناپس. P = 0.0011; تست تی دو دم. n = 5 (sgRNA کنترل)، 6 (Gpc6 sgRNA) موش. p، تعیین کمیت بیان Cas9 در آستروسیت ها از n = 4 موش. داده ها میانگین ± s.e.m هستند. * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001; مقادیر دقیق P در بالا ذکر شده است. میله های مقیاس، 5 میکرومتر (i، n) و 50 میکرومتر (گرم).