Lsp2 رژیم غذایی اولیه را به ترجمه بزرگسالان و طول عمر در مگس سرکه پیوند می دهد

تقریبا یک قرن پیش، محدود کردن رژیم غذایی در دوره‌های اولیه زندگی برای افزایش طول عمر در موش‌ها و در دافنیا پیشنهاد شد. تأثیر رژیم غذایی نوجوانان بر فیزیولوژی و طول عمر بالغین متعاقبا در موجودات مدل دیگر، از جمله مگس میوه 3، 4، 5 و موش 6، 7، 8 توصیف شده است. با این حال، مکانیسم آن به خوبی شناخته نشده است. در اینجا، با استفاده از مگس سرکه به عنوان یک مدل، نشان می‌دهیم که محدود کردن مصرف پروتئین در مرحله لاروی (محدودیت پروتئین اولیه زندگی؛ ePR) با کاهش سطح پروتئین‌های ذخیره‌سازی باعث افزایش طول عمر بزرگسالان می‌شود.

با استفاده از ردیابی ایزوتوپ پایدار، نشان می‌دهیم که اسیدهای آمینه رژیم غذایی به‌دست‌آمده در مرحله لاروی تا اوایل بزرگسالی حفظ می‌شوند و به ویژه در پروتئین‌های ریبوزومی گنجانده می‌شوند. این توسط پروتئین سرم لارو 2 (Lsp2)، یک پروتئین ذخیره‌سازی اصلی، که بیان آن در مراحل اولیه بزرگسالی به‌طور پایدار توسط ePR کاهش می‌یابد، واسطه می‌شود. خاموش کردن ژنتیکی Lsp2 فنوکپی ePR، کاهش فراوانی پروتئین ریبوزومی و فعالیت ترجمه در اوایل بزرگسالی، و افزایش طول عمر.

محدود کردن اسیدهای آمینه خاص که به ویژه در این پروتئین‌های ذخیره‌سازی غنی شده‌اند، مانند فنیل آلانین و تیروزین، برای کاهش سطح Lsp2 اولیه و افزایش طول عمر کافی است. این یافته‌ها Lsp2 را به‌عنوان حامل مولکولی تاریخچه تغذیه در طول انتقال رشد شناسایی می‌کند و وضعیت تغذیه نوجوانان را به ظرفیت ترجمه و طول عمر بزرگسالان مرتبط می‌کند. مطالعه ما مکانیسم ناشناخته ای از حافظه تغذیه ای را نشان می دهد که رژیم غذایی اولیه را به سلامت ارگانیسم مادام العمر مرتبط می کند.

محدودیت غذایی یک مداخله قوی است که پیری را به تاخیر می اندازد و طول عمر را در گونه های مختلف افزایش می دهد. دستکاری های تغذیه ای گذرا نه تنها در دوران بزرگسالی بلکه در مراحل اولیه زندگی نیز می تواند اثرات طولانی مدتی بر فیزیولوژی و طول عمر بزرگسالان داشته باشد که بسته به زمینه 4، 5، 7، 9، 10 می تواند مثبت یا منفی باشد. این پدیده که اغلب به عنوان برنامه ریزی تغذیه از آن یاد می شود، در سرتاسر گونه های 11 و 12 مشاهده شده است.

چندین فرضیه برای توضیح این برنامه ریزی ارائه شده است، از جمله تغییرات غیر قابل برگشت در ساختار اندام. تغییرات اپی ژنتیکی؛ معاوضه بین رشد، تولید مثل و نگهداری جسمی؛ هموستاز متابولیک و غدد درون ریز؛ یا میکروبیوتای روده 13، 14، 15، 16، 17.

مگس سرکه به عنوان یک مدل قدرتمند برای تشریح مکانیسم هایی که زیربنای تأثیرات محدودیت غذایی در اوایل زندگی هستند، ظهور کرده است. اگرچه برخی گزارش‌ها نشان می‌دهند که محدودیت مخمر لارو بالغ‌هایی را تولید می‌کند که کوچک هستند اما طول عمر طبیعی دارند، مطالعات دیگر شواهدی مبنی بر افزایش قابل توجه طول عمر بسته به جنس و محیط بالغ ارائه می‌کنند. در سطح مولکولی، تغییرات رونویسی در ماشین‌های ریبوزومی و انتقالی 19 یا تولید تغییر یافته اتوتوکسین‌های لیپیدی (هیدروکربن‌های کوتیکولی) 5 در بزرگسالان با عمر طولانی مشاهده شده است.

اما تاکنون، موجودیت مولکولی که اطلاعات تغذیه‌ای اولیه را در طول دوره‌های رشدی رمزگذاری، حفظ و انتقال می‌دهد، شناسایی نشده است.

برای ایجاد یک مجموعه آزمایشی برای روشن کردن مکانیسم‌های حافظه تغذیه‌ای، ما دستکاری رژیم غذایی را منحصرا در مرحله لاروی اجرا کردیم. از آنجا که مخمر به عنوان منبع غذایی اصلی اسیدهای آمینه و پروتئین برای مگس سرکه تحت شرایط آزمایشگاهی استاندارد عمل می کند، ما غلظت مخمر را در طول رشد لارو دستکاری کردیم تا محدودیت پروتئین زودرس گذرا (ePR) را ایجاد کنیم. به طور خاص، لاروهای اواخر سن دوم تقریبا 68 ساعت پس از تخم گذاری (AEL) به رژیم غذایی کم مخمر منتقل شدند.

پس از انسداد، مگس های بالغ به یک رژیم غذایی استاندارد مبتنی بر مخمر بازگردانده شدند (شکل 1a). ما ابتدا اثرات ePR را بر زمان‌بندی رشد، نرخ انسداد و رشد سیستمیک ارزیابی کردیم (شکل 1b-e). کاهش محتوای مخمر در جیره لارو از 8% به 2% یا 1% تاخیر در رشد (شکل 1b). با این حال، هنگامی که لاروها به مرحله شفیرگی رسیدند، نرخ انسداد تحت تأثیر قرار نگرفت (شکل 1c). محدودیت پروتئین وزن بدن بزرگسالان را به صورت وابسته به دوز در هر دو جنس کاهش داد (شکل 1d,e)، با مگس ماده کاهش تا 28٪ (شکل 1d,f).

اندازه بال، که یک شاخص قابل اعتماد برای رشد کلی بدن است، به طور قابل توجهی کاهش یافته است، اما تنها 7.2٪ (شکل 1 g). علاوه بر کاهش اندازه، مگس های بالغ بعد از ePR (از این پس مگس های ePR) رنگ روشن تری از دیواره بدن، به ویژه در شکم نشان دادند (شکل 1f). این نشان دهنده رنگدانه ناکافی است که به طور بالقوه ناشی از کمبود پیش سازهایی مانند تیروزین (Tyr) است که برای سنتز ملانین ضروری است 20، 21، 22.

a، نمایش شماتیک پروتکل ePR. b , c , مدت زمان نمو (b ) و نرخ انسداد (c ) مگس Canton-S. n = 6. d , e , وزن بدن مگس Canton-S ماده (d) و نر (e) در روز 1 بزرگسالی. g، اندازه بال مگس ماده Canton-S. n = 9. h، i، باروری روزانه (h) و تولید تخم مرغ تجمعی (i) از زنان Canton-S در روز 2-7 بزرگسالی. n = 10. j، تعداد تخمدان در هر تخمدان در مگس ماده Canton-S در روز 4. n = 10.

k , l , طول عمر مگس های ماده Canton-S ( k ) و نر ( l ). m، n، طول عمر مگس های Canton-S ماده (m) و نر (n) بعد از ePR با یا بدون مکمل اسید آمینه (AA) در رژیم لارو. o – r، منحنی طول عمر (o، q) و میانگین طول عمر متناظر (p، r) مگس های ماده Canton-S (o، p) یا نر (q، r). مگس‌های ePR با یک رژیم غذایی مصنوعی با غلظت‌های اسید آمینه متفاوت در مرحله بزرگسالی تغذیه می‌شوند. نوارهای خطا در p , r نشان دهنده 95% فواصل اطمینان هستند. اندازه های نمونه (n) برای آزمایش های طول عمر داده شده است. داده ها میانگین ± s.e.m هستند. در b – j.

نمادها نشان دهنده تکرارهای بیولوژیکی هستند. معناداری آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون مقایسه چندگانه دانت (c – e)، آزمون t دانشجوی دو طرفه (g)، آنالیز واریانس دو طرفه با آزمون مقایسه چندگانه دانت (h)، آنالیز واریانس یک‌طرفه با آزمون مقایسه چندگانه Holm–Šídák (i, log-rk) یا آزمون (i , k j ) تعیین شد.

در مرحله بعد، ما فنوتیپ های بالغ این مگس های ePR را مشخص کردیم. علیرغم اینکه مگس های ePR ماده پس از انسداد در یک رژیم غذایی استاندارد پرورش داده شدند، باروری ضعیفی را نشان دادند، به ویژه در اوایل بزرگسالی (شکل 1h,i). این با کاهش وابسته به دوز در تعداد تخمدان ها همراه بود (شکل 1j)، مطابق با گزارش هایی که تعداد تخمدان ها در مرحله لاروی تعیین می شود و به تغذیه لارو حساس است 18، 23. این نتایج نشان می دهد که ePR اثرات رشدی برگشت ناپذیری بر رشد جسمی و اندام های تولید مثلی دارد.

هنگامی که در مرحله بزرگسالی با یک رژیم غذایی استاندارد تغذیه می‌شد، مگس‌های ePR طول عمر بیشتری را در هر دو جنس نشان دادند (شکل 1k,l). برای تعیین اینکه آیا این اثر طول عمر به طور خاص به کاهش سطح پروتئین (اسید آمینه) نسبت داده می شود، به جای سایر مواد مغذی مشتق شده از مخمر، ما رژیم لارو مخمر 1٪ را با یک کوکتل اسید آمینه بر اساس ترکیب تعریف شده یک جیره مصنوعی تکمیل کردیم 24، 25، 26 (به روش ها مراجعه کنید). این مکمل به طور موثر افزایش طول عمر را در مگس‌های ePR از هر دو جنس لغو کرد (شکل 2).

1m,n)، نشان می دهد که طول عمر ناشی از ePR به دلیل در دسترس بودن اسید آمینه است. این بیشتر با استفاده از HolFast، یک رژیم غذایی تعریف شده شیمیایی که برای لاروها طراحی شده است، تأیید شد. کاهش اسیدهای آمینه جیره به نصف یا یک چهارم به طور خاص در مرحله لاروی طول عمر بزرگسالی را تحت شرایط استاندارد رژیم غذایی افزایش داد (داده های توسعه یافته شکل 1a,b).

سپس بررسی کردیم که آیا زمان‌بندی ePR بر اثر افزایش طول عمر تأثیر می‌گذارد یا خیر. ePR آغاز شده در مرحله سن سوم (94 ساعت AEL) - نقطه ای که در آن لاروها می توانند حتی در صورت محرومیت کامل از مخمر زنده بمانند - همچنین باعث افزایش طول عمر می شود (داده های توسعه یافته شکل 1c,d). به طور قابل‌توجهی، محرومیت کامل از مخمر (0٪ رژیم غذایی مخمر) در این مرحله منجر به افزایش طول عمر بیشتر از رژیم‌های 1٪ یا 2٪ مخمر شد (داده‌های توسعه یافته شکل 1c,d). با هم، این نتایج نشان می دهد که محدود کردن در دسترس بودن اسید آمینه در مراحل جوانی، طول عمر را افزایش می دهد.

برای تعیین اینکه آیا این اثر طول عمر به زمینه رژیم غذایی بزرگسالان بستگی دارد، ما طول عمر مگس‌های ePR را در طیف وسیعی از غلظت‌های اسید آمینه رژیم غذایی بزرگسالان بررسی کردیم. مگس‌های ePR افزایش طول عمر را در طیف وسیعی از غلظت‌های اسید آمینه (100-100%) نشان دادند و این اثر تحت شرایط شدید رژیم غذایی (0% یا 300% اسیدهای آمینه) لغو شد (شکل 1o-r).

مطابق با این مشاهدات، تجزیه و تحلیل خطرات متناسب کاکس هیچ اثر متقابل قابل توجهی بین جیره لارو و رژیم غذایی بالغ در محدوده فیزیولوژیکی غلظت آمینواسید تشخیص نداد، اگرچه یک تعامل قابل توجه در مگس ماده زمانی که شرایط غذایی شدید گنجانده شد ظاهر شد (جدول تکمیلی 1). این نتایج نشان می دهد که افزایش طول عمر ناشی از ePR در طیف گسترده ای از سطوح اسید آمینه بزرگسالان حفظ می شود و بنابراین به یک شرایط اسید آمینه خاص بزرگسالان محدود نمی شود.

افزایش طول عمر ارتباط نزدیکی با کاهش سیگنال دهی انسولین دارد 28 . گزارش شده است که محرومیت مخمر در اواخر مرحله لاروی باعث کاهش سیگنال دهی انسولین و هورمون جوانی (JH) در مگس بالغ می شود 18 که هر دو می توانند طول عمر مگس سرکه را تنظیم کنند 29 . ما دریافتیم که ePR سطوح فسفریله Akt (p-Akt) را در لاشه شکمی (غنی شده با بدن چربی) زنان بالغ 2 روزه کاهش می دهد، که نشان دهنده سرکوب سیگنال انسولین است (داده های توسعه یافته شکل 2a,b).

مطابق با این سرکوب، ما فعال شدن فاکتور رونویسی FoxO (جعبه سر چنگال، زیر گروه O) را مشاهده کردیم که معمولا توسط سیگنال دهی انسولین سرکوب می شود. این با تنظیم مثبت ژن‌های هدف FoxO، از جمله گیرنده شبه انسولین (InR) و پپتید شبه انسولین 6 (Ilp6)، در لاشه شکم مشهود بود (داده‌های توسعه یافته شکل 2c,d). در مقابل، بیان همولوگ فاکتور رونویسی Kr 1 (Kr-h1)، یک ژن هدف سیگنال دهی JH، توسط ePR بدون تغییر باقی ماند (داده های توسعه یافته شکل 2e).

علاوه بر این، بیان ماده خاص مستقل از ترانسفورماتور (تناسب)، که توسط یک گزارشگر GFP مشاهده شد، در شکم مگس‌های ePR سرکوب شد، که نشان‌دهنده کاهش فعالیت سیگنال‌دهی انسولین-مکانیستی سیستمیک راپامایسین (mTOR) است 30، 31 (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2f). کاهش بیان پپتیدهای شبه انسولین در سر، سرکوب کلی محور سیگنال دهی انسولین را بیشتر تایید کرد (داده های توسعه یافته شکل 2g-i).

قابل ذکر است که این سرکوب گذرا بود. سطوح p-Akt و بیان InR تا روز 7 پس از انسداد به سطوح کنترل بازگشتند (داده های توسعه یافته شکل 2j-l). فاکتور رونویسی فعال 4 (ATF4) یکی دیگر از فاکتورهای رونویسی است که با کاهش اسید آمینه رژیم غذایی 32 فعال می شود. ما فعالیت آن را با استفاده از خط 33 اینترون -dsRed گزارشگر 4E-BP زیر نظر گرفتیم و دریافتیم که ATF4 تا روز 2 بزرگسالی در مگس‌های ePR فعال باقی مانده است. با این حال، این فعالیت تا روز 5 به سطح پایه بازگشت (داده های توسعه یافته شکل 2m,n).

در مجموع، این یافته‌ها نشان می‌دهد که محدودیت مواد مغذی لارو مسیرهای سنجش مواد مغذی را تنها به‌طور موقت در مرحله اولیه بزرگسالی تعدیل می‌کند.

تجزیه و تحلیل فنوتیپی ما نشان می دهد که مصرف پروتئین در اوایل زندگی تأثیر طولانی بر فیزیولوژی و طول عمر اوایل بزرگسالی دارد. تلاش‌های قبلی برای ردیابی مواد مغذی مشتق شده از لارو در بزرگسالی، از مخمرهای نشاندار شده با ایزوتوپ پایدار (15 N, 13 C در مقابل 14 N, 12 C) برای تعیین کمیت گردش کربن و نیتروژن استفاده کرده‌اند. این تجزیه و تحلیل ها، همراه با محدودیت غذایی بزرگسالان، برای ارزیابی استراتژی های سرمایه گذاری مواد مغذی در بافت های بدنی و تولید مثلی استفاده شده است.

مشخص شد که نیتروژن مشتق شده از لارو به آهستگی با نیتروژن مشتق شده از بالغ که به تخم‌ها و بافت‌های بدنی عرضه می‌شود، زمانی که رژیم غذایی بزرگسالان محدود می‌شود، جایگزین می‌شود. این مشاهدات پرسش‌های اساسی را مطرح می‌کنند: چگونه پروتئین‌های خاص لارو به مرحله بزرگسالی منتقل می‌شوند، و چگونه حیوانات از استفاده از اسیدهای آمینه مشتق شده از لارو به آمینو اسیدهای اکتسابی بالغ برای سنتز پروتئین‌های خاص منتقل می‌شوند؟ برای پاسخ به این سؤالات، باید گردش پروتئوم پروتئین ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد.

برای ردیابی سرنوشت آمینو اسیدها و پروتئین ها در طول انتقال به بزرگسالی، ما از برچسب گذاری ایزوتوپ پایدار پالس در داخل بدن توسط اسیدهای آمینه در کشت سلولی (in vivo pSILAC) از طریق یک رژیم غذایی مصنوعی استفاده کردیم. لاروها با یک جیره مصنوعی «سنگین» حاوی لیزین نشاندار شده با ایزوتوپ (+8 Lys؛ 13 C 6، 15 N 2) و آرژنین (+10 Arg؛ 13 C6، 15 N 4) به جای همتایان «سبک» (طبیعی) خود پرورش داده شدند (شکل).

این رویکرد امکان جایگزینی کامل این اسیدهای آمینه غذایی با ایزوتوپ های پایدار را بدون ایجاد اختلال در رشد لارو فراهم می کند و امکان تعیین کمیت دقیق گردش پروتئوم را در شرایط فیزیولوژیکی فراهم می کند. پس از انسداد، مگس‌های بالغ به رژیم غذایی مصنوعی حاوی Lys (+4 Lys؛ D4) و Arg (+6 Arg؛ 13 C6) با ایزوتوپ "متوسط" تغییر یافتند. پس از سه و شش روز تغذیه بزرگسالان، ما ترکیب ایزوتوپی پروتئین‌ها را با استفاده از کروماتوگرافی نانو مایع و طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (nanoLC-MS/MS) اندازه‌گیری کردیم.

ما از نمونه‌های سر استفاده کردیم که شامل بافت‌های مختلفی از جمله مغز، اپیدرم، ماهیچه، هموسیت‌ها و بدن چربی بود، اما نه تخمدان و روده. از آنجایی که سلول های بنیادی سوماتیک در مگس سرکه بزرگسالان عمدتا در روده قرار دارند، تقسیم سلولی در سر ناچیز است و امکان ارزیابی مستقیم گردش پروتئوم مستقل از تکثیر سلولی را فراهم می کند.

a، گردش کار تجربی برای pSILAC in vivo. b , c , فراوانی نسبی پروتئین های دارای برچسب سبک، متوسط ​​و سنگین در لاروهای سرگردان (b) و سر بالغ (c) مگس ماده Canton-S. فراوانی پروتئین با کمیت مطلق مبتنی بر شدت (iBAQ) برآورد شد. n = 4. d، طیف جرمی پپتیدهای His2B و RpL22. L، نور؛ M، متوسط; H، سنگین e، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی GO از 25 درصد فراوان‌ترین پروتئین‌های برچسب‌دار سنگین در سر بزرگسالان در روز 3. مقادیر q با استفاده از مقادیر P تنظیم‌شده برای آزمایش‌های چندگانه با بنجامینی-هوچبرگ محاسبه شد و -log 10 تبدیل شد.

f - h، آنالیز پروتئوم در سر مگس‌های ماده Canton-S در روز 2. f، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی GO پروتئین‌ها با ePR کاهش یافت (P <0.01 و ورود به سیستم 2 (1٪/8٪ <-0.1). g، نمودار آتشفشانی که فراوانی پروتئین متفاوت را نشان می دهد. CytoRP ها و mitoRP ها به ترتیب با رنگ های قرمز و آبی مشخص شده اند. h، توزیع تغییرات log 2 برابری برای همه پروتئین ها (n = 6025)، cytoRPs (n = 81) و mitoRPs (n = 72). من، طرح تجربی تجزیه و تحلیل pSILAC in vivo همراه با ePR.

لاروهای Canton-S با جیره 1% یا 8% مخمر تغذیه شدند، سپس بزرگسالان با جیره مصنوعی حاوی اسیدهای آمینه برچسب دار با ایزوتوپ سنگین به مدت 1، 2، 3 یا 6 روز تغذیه شدند. j، نسبت فراوانی پروتئین با برچسب سبک و سنگین در سر مگس ماده. k، شدت cytoRPs، mitoRPs و هیستون های دارای برچسب سبک و سنگین. نقطه ها نشان دهنده شدت متوسط ​​هر گروه پروتئینی هستند. n = 4. a.u.، واحد دلخواه. l، نمودار آتشفشانی که فراوانی متفاوت پروتئین های نشاندار شده با نور (مشتق از لارو) را در سرهای بالغ در روز 2 نشان می دهد.

متر، توزیع تغییرات log 2 برابری برای پروتئین های نشاندار شده با نور برای همه پروتئین ها (n = 7,443)، cytoRPs (n = 81) و mitoRPs (n = 71). n , o , immunoblot در روز 2 ( n ) و کمی سازی ( o ) سنتز پروتئین در سرهای ماده بالغ. n = 4. داده ها میانگین ± s.d هستند. (ب، ج، ج، ک)؛ نمودارهای جعبه ای که میانه، چارک ها و محدوده را نشان می دهد (h، m). یا میانگین ± s.e.m. (o). نمادها نشان دهنده تکرارهای بیولوژیکی هستند.

معنی‌داری آماری با استفاده از آزمون مجموع رتبه‌ای دو طرفه ویلکاکسون (g، h، l، m)، آزمون t دو طرفه ولش با تصحیح بنجامینی-هوکبرگ (k) یا آنالیز واریانس یک‌طرفه با آزمون مقایسه چندگانه هولم-شیداک (o) تعیین شد.

آنالیز پروتئومی نتایج بسیار قابل تکراری را به همراه داشت، همانطور که با همبستگی قوی نسبت های برچسب گذاری سنگین/متوسط ​​بین تکرارهای بیولوژیکی مشهود است (داده های توسعه یافته شکل 3a). ما ابتدا تأیید کردیم که کارایی برچسب‌گذاری در پایان مرحله لاروی 99.4 درصد بود که نشان دهنده ادغام موفقیت‌آمیز اسیدهای آمینه سنگین در پروتئوم لارو بود (شکل 2b و جدول تکمیلی 2). در روز 3 بزرگسالی، پروتئین های سنگین مشتق شده از لارو 63.7 درصد از کل پروتئوم را تشکیل می دادند که از پروتئین های محیط تازه سنتز شده بیشتر بود.

این نسبت متعاقبا تا روز 6 به 45.8 درصد کاهش یافت (شکل 2c و جدول تکمیلی 2). این یافته ها نشان می دهد که پروتئوم زودرس بخش قابل توجهی از پروتئین های ساخته شده از اسیدهای آمینه لارو را حفظ می کند (شکل 2c). توجه داشته باشید که این پروتئین‌های مشتق شده از لارو می‌توانند (1) پروتئین‌هایی با عمر طولانی باشند که از مرحله لاروی دست نخورده منتقل می‌شوند یا (2) پروتئین‌هایی که به تازگی در طی دگردیسی یا اوایل بزرگسالی با بازیافت پروتئین‌های لارو سنتز شده‌اند.

مطابق با احتمال قبلی، هیستون‌هایی مانند هیستون H2B (H2B) که به عنوان طولانی‌مدت شناخته می‌شود، به طور قابل توجهی با ایزوتوپ سنگین غنی شدند (شکل 2d).

تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ژن هستی‌شناسی (GO) پروتئین‌های فراوان برچسب‌گذاری‌شده توسط ایزوتوپ‌های سنگین در روز 3 و 6، ترجمه سیتوپلاسمی را به‌عنوان بالاترین ضربه و به دنبال آن انتقال الکترون میتوکندریایی شناسایی کرد (شکل 2e و داده‌های توسعه‌یافته شکل 3b). به طور قابل‌توجه، 77 پروتئین ریبوزومی (RPs) (73 سیتوزولی و 4 میتوکندریایی) در پروتئوم اولیه بزرگسالان غنی‌تر بودند (25 درصد بالا) (جدول تکمیلی 2).

به عنوان مثال، پروتئین ریبوزومی 60S L22 (RpL22) سطوح ایزوتوپ سنگین بالایی را در روز 3 نشان داد. با این حال، نسبت سنگین/متوسط ​​تا روز 6 به سرعت کاهش یافت، که نشان دهنده نرخ گردش بالاتر در مقایسه با هیستون ها است (شکل 2d). این داده ها نشان می دهد که RP ها در اوایل بزرگسالی یا از مرحله رشد منتقل می شوند یا با استفاده از استخرهای اسید آمینه مشتق شده از لارو سنتز می شوند. برای تمایز بین حمل پروتئین و بازیافت اسید آمینه، ما پپتیدهای کایمریک 38 ناقص هضم شده از RpS25 و RpLP0 را تجزیه و تحلیل کردیم.

این پپتیدها حاوی Lys با برچسب سنگین و متوسط ​​در یک زنجیره پپتیدی مشابه در نمونه‌های سر روز 3 و 6 بودند که نشان می‌دهد پپتیدها از اسیدهای آمینه بازیافتی مشتق شده از لارو و اسیدهای آمینه مشتق شده از بزرگسالان سنتز می‌شوند (داده‌های توسعه یافته شکل 3c). این یافته شواهدی را ارائه می دهد که پروتئین های مشتق شده از لارو نه تنها دست نخورده حمل می شوند، بلکه از اسیدهای آمینه مشتق شده از پروتئین های تولید شده در مراحل رشد نیز به صورت de novo سنتز می شوند.

برای درک جامع اینکه چگونه ePR بر فراوانی پروتئین بزرگسالان و پروفایل‌های بیان تأثیر می‌گذارد، ما کمی‌سازی اسید آمینه، آنالیز پروتئوم و آنالیز توالی‌یابی RNA (RNA-seq) را روی مگس‌های زودرس انجام دادیم. برای تعیین کمیت اسید آمینه، نمونه‌های کل بدن تحت هیدرولیز اسیدی قرار گرفتند (به روش‌ها مراجعه کنید) تا محتوای اسید آمینه کل، شامل هر دو اسید آمینه متصل به پروتئین و اسیدهای آمینه آزاد، تعیین شود. مگس‌های ePR از هر دو جنس کاهش قابل‌توجهی در سطح کل اسید آمینه، حتی پس از نرمال‌سازی وزن بدن نشان دادند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3d,e).

فراتر از این کاهش کمی، ما تغییرات مشخصی را در ترکیب اسید آمینه مشاهده کردیم (داده های توسعه یافته شکل 3f,g). به عنوان مثال، در مگس ماده، والین، آلانین و پرولین توسط ePR افزایش یافت، در حالی که آرژنین، لیزین، فنیل آلانین (Phe) و Tyr کاهش یافت (داده های توسعه یافته شکل 3f). این تغییرات ترکیبی نشان می دهد که ePR اساسا مشخصات اسید آمینه بزرگسالان را تغییر می دهد، به طور بالقوه از طریق یک سوگیری در حمل آمینو اسیدها و پروتئین های خاص از مرحله لاروی.