TRAM انتقال سیگنال میدوزوم بدون گیرنده تلفن را ترویج می کند

در مسیرهای انتقال سیگنال گیرنده Toll مانند (TLR)، گیرنده های فعال شده تنها برای چند دقیقه در مجتمع های سیگنال دهی اولیه غشایی به نام پروتو-میدوزوم 1 وجود دارند. پروتو میدوزوم‌ها به سرعت از TLRها آزاد می‌شوند تا خودآرایی شوند (یعنی بالغ شوند) در مراکز سازمان‌دهنده فوق مولکولی سیتوزولی غنی از آنزیم به نام میدوزوم‌های 2، 3، 4. میدوزوم ها بیان ژن التهابی چند ساعته را القا می کنند 5، 6، 7، 8، 9، 10. مکانیسم کنترل انتشار پروتو-میدوزوم و تأثیر آن بر انتقال سیگنال تعریف نشده است.

در اینجا ما عواملی را شناسایی می‌کنیم که فرآیند بلوغ پروتو-میدوزوم‌ها را به میدوزوم‌های سیتوزولی عاری از گیرنده تنظیم می‌کنند. از طریق یک صفحه نمایش ژنتیکی در ماکروفاژها، ما TRAM را که قبلا برای کنترل سیگنال‌دهی TLR مستقل از MyD88 توصیف شده بود، به عنوان تنظیم‌کننده مجموعه myddosome شناسایی می‌کنیم. با استفاده از بیوشیمی، تصویربرداری سلول زنده و بازسازی فعالیت با پروتئین‌های نوترکیب، نشان می‌دهیم که آداپتور TIRAP مرتبط با غشای پلاسما، پروتو میدوزوم‌های 12، 13 را تولید می‌کند، پس از آن TRAM MyD88 را از مجموعه TLR-TIRAP جدا می‌کند تا بلوغ و بلوغ نشانه‌های پایین‌دستی را فعال کند.

ransduction 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . در غیاب TRAM، MyD88 نمی تواند از کمپلکس TLR-TIRAP جدا شود، که منجر به برهمکنش های غیرعادی و ناپایدار MyD88 با آنزیم های سیگنال دهی پایین دست می شود. این یافته‌ها ما را قادر می‌سازد تا فعالیت‌های میدوزوم طولانی‌مدت وابسته به TRAM را به‌عنوان تعیین‌کننده دو مشخصه مسیر TLR شناسایی کنیم: فعال‌سازی NF-kB ساعت‌ها ۲۰، ۲۱، ۲۲، ۲۳، ۲۴ و بیان ژن پاسخ ثانویه ۲۵، ۲۶، ۲۷. تفکیک شیمیایی میدوزوم‌های سیتوزولی، فعالیت‌های التهابی موجود سلول‌های تحریک‌شده با TLR را در شرایط in vitro و in vivo مختل کرد.

در مجموع، این کار TRAM را به عنوان یک تنظیم کننده بلوغ و سیگنال دهی میدوزوم ایجاد می کند و پایه مولکولی را برای انتقال سیگنال بدون گیرنده فراهم می کند.

TLRها پروتئین‌های گذرنده هستند که محصولات میکروبی و لیگاندهای درون‌زا را شناسایی می‌کنند که در مجموع به عنوان الگوهای مولکولی مرتبط با بیماری‌زا و آسیب (به ترتیب PAMPs و DAMPs؛ معمولا اجزای دیواره سلولی باکتریایی، اسیدهای نوکلئیک یا مولکول‌های مشتق شده از میزبان که نشان‌دهنده آسیب بافتی هستند) نامیده می‌شوند. بنابراین، TLR ها محافظ التهاب و ایمنی تطبیقی ​​محسوب می شوند 30، 31. کار اخیر روی مسیرهای سیگنال دهی درون زا TLR یک فعالیت غیرمعمول را نشان داد 1 .

به جای مونتاژ میدوزوم‌ها در اطراف دم سیتوزولی TLRها، همانطور که از دیدگاه‌های کلاسیک انتقال سیگنال با واسطه گیرنده انتظار می‌رود، TLR‌های فعال، مجموعه‌ای از خوشه‌های کوچک MyD88 را که به آنها پروتو میدوزوم‌ها گفته می‌شود، تشکیل می‌دهند. پروتو میدوزوم‌ها متعاقبا از TLR به داخل سیتوزول آزاد می‌شوند، جایی که با ترکیب پروتئین‌های سیگنال‌دهنده تحریک‌کننده التهاب که در تمام مراحل مسیر TLR عمل می‌کنند، اندازه رشد کرده و بالغ می‌شوند.

این بینش ها این سوال را مطرح می کند که چگونه پروتو-میدوزوم ها از TLR ها آزاد می شوند و آیا وضعیت عاری از گیرنده میدوزوم ها مهم است یا خیر. در اینجا ما تنظیم کننده های این مکانیسم نامتعارف انتقال سیگنال را شناسایی می کنیم.

ما یک روش مبتنی بر فلوسیتومتری را برای جداسازی سلول‌های حاوی میدوزوم از سلول‌های فاقد میدوزوم (که به آن‌های اطراف گفته می‌شود) ایجاد کردیم. این سنجش بر این مفهوم استوار است که تعداد زیادی از میدوزوم‌های با اندازه میکرومتر در سلول‌های منفرد وقتی با استفاده از فلوسیتومتری ارزیابی می‌شوند، ویژگی‌های پراکندگی جانبی (SSC) را تغییر می‌دهند. برای آزمایش این ایده، ما از ماکروفاژهای مشتق شده از مغز استخوان جاودانه (iBMDMs) استفاده کردیم که حاوی یک تگ دو آللی یک برچسب AGF (Apex2-mEGFP-Flag) در جایگاه درون زا است که مؤلفه myddosome MyD88 را کد می کند (رجوع 1).

iBMDM های MyD88-AGF تیمار شده با لیپوپلی ساکارید باکتریایی (LPS)، یک لیگاند TLR4، تغییری را از خواص کم SSC همگن به سمت اکثر سلول ها با SSC بالا نشان دادند (شکل 1a). تصویربرداری از سلول‌ها پس از مرتب‌سازی، جداسازی فنوتیپی را تأیید کرد، با سلول‌های بالای SSC (به عنوان پاسخ‌دهنده) حاوی خوشه‌هایی از MyD88-AGF (یعنی میدوزوم‌ها). سلول‌های مشاهده‌کننده پایین SSC، که یک جمعیت اقلیت را نشان می‌دهند، حاوی میدوزوم نیستند (شکل 1a).

ما آنالیز توالی‌یابی RNA (RNA-seq) را برای مقایسه سلول‌های پاسخ‌دهنده و تماشاگر پس از مرتب‌سازی انجام دادیم و به‌علاوه جمعیت‌های حجیم (غیر مرتب‌شده) سلول‌های تیمار نشده و تیمار شده با LPS را تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 1a-c، شکل تکمیلی 1 و داده‌های تکمیلی 2). در مجموع، 2380 ژن به طور متفاوت در تمام نمونه ها بیان شد (DEGs؛ P تنظیم شده (P adj) <0.01، |log 2 [تغییر برابر (FC)]| > 1؛ تکمیلی شکل 1a).

تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA)، خوشه‌بندی و مقایسه‌های فردی نشان داد که پاسخ‌دهنده‌های بالا SSC شبیه سلول‌های انبوه درمان‌شده با LPS هستند، در حالی که تماشاگران پایین SSC یک رونوشت متمایز را نشان می‌دهند (شکل 1b و شکل تکمیلی 1). سلول‌های پاسخ‌دهنده نسبت به اطرافیان و سلول‌های درمان‌نشده، ژن‌های پاسخ اولیه (PRGs) و ژن‌های پاسخ ثانویه (SRGs) را به‌طور انتخابی القا کردند (شکل 1c). اگرچه سلول‌های اطراف برای القای ژن‌های پاسخ TLR معیوب بودند، اما این سلول‌ها غیرفعال نبودند.

مانند پاسخ دهندگان، تماشاگران یک امضای ژن تحریک شده با اینترفرون (IFN) (ISG) را نشان دادند که نشان می دهد این سلول ها به سیتوکین ها و سایر عوامل (مانند IFNs) تولید شده توسط سلول های پاسخ دهنده پاسخ داده اند (شکل 1c). مطابق با این ایده، تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری سلول های تیمار شده با LPS (تحت درمان با برفلدین A برای جلوگیری از ترشح سیتوکین) نشان داد که سلول های پاسخ دهنده، اما نه افراد حاضر، IL-6 و TNF تولید می کنند (شکل 1d). رنگ آمیزی برای تترین محصول ISG موضعی در غشای پلاسما تایید کرد که تیمار برفلدین A از فعالیت IFN در همه سلول ها جلوگیری می کند (شکل 1d).

در غیاب برفلدین A، هر دو جمعیت به طور مساوی تترین را بیان کردند (شکل 1d). بنابراین، سلول های حاوی میدوزوم منبع اصلی برنامه رونویسی القا شده با LPS هستند.

الف، استراتژی غربالگری و مرتب سازی. سلول‌ها توسط SSC به تماشاگران (SSC low) و پاسخ‌دهنده (SSC high) جدا شدند و سپس برای تجزیه و تحلیل غنی‌سازی RNA-seq یا sgRNA پردازش شدند. استراتژی دروازه‌بندی فلوسیتومتری مبتنی بر تغییرات SSC در سلول‌های تحریک‌شده با LPS (6 ساعت) است. تصاویری از جمعیت های مرتب شده نشان داده شده است. خاکستری، MyD88. میله های مقیاس، 10 میکرومتر. b، PCA داده‌های RNA-seq سلول‌های تحت درمان با LPS (6 ساعت) در جمعیت‌های پاسخ‌دهنده و تماشاگر طبقه‌بندی شدند.

ج، پروفایل رونویسی اطرافیان در مقابل پاسخ دهندگان در برابر بیان ژن القا شده با LPS ترسیم شده است.، d، تعیین کمیت پروتئین ها نشان داده شده است (میانگین شدت فلورسانس (MFI)) پس از تحریک LPS (6 ساعت) در iBMDM هایی که با برفلدین A (BrefA) درمان شده اند. e، خروجی از تجمع رتبه ای قوی MAGeCK که غنی سازی سطح ژن را در سراسر صفحه CRISPR برای عدم وجود میدوزوم و فعال سازی NF-κB نشان می دهد. پروتئین‌های TLR متعارف (can. TLR)، کمپلکس الیگوساکاریل ترانسفراز (OSTc) و پروتئین‌های سیگنال‌دهنده برجسته شده‌اند.

f، تجزیه و تحلیل ایمونوبلات بیان TRAM در iBMDM های تحریک شده با LPS (6 ساعت) پس از مرتب سازی. g، تصاویر خطوط MyD88–AGF iBMDM WT یا KO که با LPS یا LTA درمان شده اند (3 ساعت). نوک پیکان MyD88 را در غشای پلاسمایی نشان می دهد. آبی، هسته؛ خاکستری، MyD88. میله های مقیاس، 10 میکرومتر. h، کمی کردن چگالی پروتو-میدوزوم و اندازه متوسط ​​از تصویربرداری TIRF (داده های توسعه یافته شکل 2b). i , ردیابی رفتار myddosome از تصویربرداری کانفوکال (فیلم تکمیلی 1).

تعیین کمیت میدوزوم ها در هر سلول، نسبت سلول های حاوی میدوزوم و جابجایی میانه غشای میدوزوم پس از تحریک PAMP. تصاویر در a و g نماینده n = 3 آزمایش هستند. داده ها در یک نشان دهنده یک نماینده از n> 12 نوع سلول است. داده های b و c نتایج RNA-seq را از n = 4 تکرار نشان می دهد. برای d، h و i، داده ها میانگین ± s.e.m هستند. از n = 3 آزمایش. داده های موجود در e نمرات سه sgRNA در هر ژن را نشان می دهد. مقادیر P در d با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) در مقایسه با سلول های تیمار نشده محاسبه شد.

منبع ژل، داده های صفحه RNA-seq و CRISPR در داده های تکمیلی 1 تا 3 ارائه شده است.

برای شناسایی تنظیم‌کننده‌های مجموعه myddosome، از این رویکرد مبتنی بر مرتب‌سازی برای انجام یک صفحه نمایش CRISPR در سطح ژنوم استفاده کردیم. برای افزایش وفاداری سلول‌های بالا SSC برای گزارش سیگنال‌دهی TLR، ما یک گزارشگر NF-kB فلورسنت را در iBMDM‌های MyD88–AGF معرفی کردیم و Cas9 را به‌طور پایدار بیان کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a,b). گزارشگر NF-κB با الکتروپوریشن RNA تک راهنما (sgRNA) که Myd88، Tlr2 یا Tlr4 را هدف قرار می دهد، و به دنبال آن تحریک TLR 33 تأیید شد (داده های توسعه یافته شکل 1c).

سلول‌ها از همه ژنوتیپ‌ها پاسخ گزارشگر NF-κB به TNF را حفظ کردند، اما به طور انتخابی پاسخ‌دهی به LPS یا اسید لیپوتیکوئیک باکتریایی لیگاند TLR2 (LTA) را به شیوه‌ای خاص گیرنده از دست دادند (داده‌های توسعه یافته شکل 1c). ما کتابخانه Julianna sgRNA 34 را به این سلول‌ها معرفی کردیم، با LPS یا LTA تحریک شد و سلول‌های SSC کم NF-κB را برای غنی‌سازی جهش‌های معیوب در مونتاژ میدوزوم و فعال‌سازی NF-kB مرتب کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1d). آنالیز توالی یابی sgRNA ها نشان داد که کمترین افت راهنما و پیچیدگی بالا حفظ شده است (داده های توسعه یافته شکل.

1e) و ژن‌های ضروری در کنترل‌های درمان‌نشده در مقابل ورودی پلاسمید (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1f) تخلیه شدند، که با هم کیفیت صفحه و کتابخانه را تأیید می‌کنند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1e,f). تجزیه و تحلیل تجمع رتبه قوی (با استفاده از MAGeCK) 35 تنظیم کننده های مثبت مجموعه myddosome و سیگنال دهی NF-κB را شناسایی کرد (شکل 1e)، که ما آن را در سطح sgRNA و ژن تایید کردیم (داده های توسعه یافته شکل 1g و داده های تکمیلی 3). ژن‌های کدکننده مؤلفه‌های سیگنال‌دهی متعارف TLR، چاپرون‌ها و فاکتورهای مرتب‌سازی غشایی در جمعیت‌های سلولی کم NF-kB SSC 36 غنی شدند (شکل 1e).

Rela بالاترین موفقیت را داشت و گزارشگر NF-κB را تأیید کرد (شکل 1e). نکته قابل توجه، Ticam2 (رمز رمزگذاری کننده TRAM) در بین بهترین موارد برای درمان LPS و LTA قرار گرفت. این یافته غیرمنتظره بود، زیرا TRAM یک تنظیم کننده مسیرهای سیگنالینگ TLR مستقل از MyD88 است. TRAM TLR4 درون اندوزوم ها را به TRIF پیوند می دهد تا بیان IFN را پس از اندوسیتوز TLR4 20، 37، 38، 39 واسطه کند. TRAM همچنین بیان ضعیف IFN ناشی از TLR2 را واسطه می کند (مراجعه 40، 41، 42). ژن کد کننده TRIF (Ticam1) در سلول های بدون پاسخ تیمار شده با LPS یا LTA غنی نشده بود (شکل 1e).

بر اساس این یافته‌ها، داده‌های RNA-seq که در بالا توضیح داده شد را مجددا بررسی کردیم (شکل 1c). در میان 248 ژنی که بیان آنها در بینندگان کمتر از پاسخ دهندگان بود و با درمان LPS بدون تغییر بود، Ticam2 تنها ژنی بود که با ضربه های صفحه CRISPR همپوشانی داشت (شکل 1c,e). کاهش بیان Ticam2 در سلول های اطراف (شکل تکمیلی 1c) در سطح پروتئین تایید شد (شکل 1f). این مجموعه داده‌ها، همراه با گزارش‌های تعاملات TRAM-MyD88 در سلول‌های HEK293 41، 43، تحقیقات عمیق‌تری را برانگیخت.

با استفاده از ناک اوت CRISPR-Cas9 (KO) در iBMDM های MyD88-AGF، بسیاری از فاکتورهای سیگنالینگ بررسی شده به شکل گیری میدوزوم آسیب نمی رسانند و احتمالا به دلیل فعال سازی معیوب NF-κB به عنوان ضربه های صفحه شناسایی شده اند (داده های توسعه یافته شکل 2a). در مقابل، سلول‌های فاقد TLR یا تنظیم‌کننده مونتاژ میدوزوم TIRAP 44، 45، 46، 47 قادر به جمع‌آوری میدوزوم‌ها نبودند (شکل 1g). در مورد TRAM، یک فنوتیپ منحصر به فرد مشاهده شد. سلول های دارای کمبود TRAM فاقد میدوزوم سیتوزولی بودند اما کمپلکس های MyD88 را در غشای پلاسمایی حفظ کردند (شکل 1g).

ما این فنوتیپ را با استفاده از میکروسکوپ بازتاب داخلی کل (TIRF) پس از تحریک PAMP تعیین کردیم (شکل 1h و داده های توسعه یافته شکل 2b). پروتو میدوزوم ها به سرعت در همه سلول ها به جز سلول هایی که فاقد TIRAP هستند تشکیل می شوند (شکل 1h). در سلول های نوع وحشی (WT) و ∆ Ticam1، پروتو میدوزوم ها عمدتا در عرض 1 ساعت از غشای پلاسمایی ناپدید شدند (شکل 1h). در سلول های ∆ Ticam2، کمپلکس های MyD88 در غشاء باقی ماندند (شکل 1h). وضوح TIRF نشان داد که پروتو میدوزوم های حفظ شده در سلول های ∆ Ticam2 در اندازه بیش از 2 ساعت تغییر نکرده اند (شکل 1h).

تصویربرداری سلول زنده (فیلم تکمیلی 1) و کمی سازی تشکیل خوشه MyD88 فرکانس های پاسخ مشابه را در بین ژنوتیپ ها تایید کرد و سلول های ∆ Ticam2 خوشه های MyD88 را تشکیل دادند که نتوانستند از غشاء جدا شوند (شکل 1i). این یافته ها نشان می دهد که TRAM مونتاژ myddosome را کنترل می کند.

برای تشریح بیوشیمیایی فعالیت‌های MyD88، ما در اولین ساعت پس از تحریک PAMP، رسوب ایمنی MyD88 را از MyD88-AGF iBMDM در فواصل 5 دقیقه انجام دادیم (داده‌های توسعه یافته شکل 3a). ما دریافتیم که MyD88 به سرعت با TIRAP و گیرنده بذر (TLR4 پس از تحریک LPS) تعامل دارد. این فعل و انفعالات در طول زمان کاهش یافت (داده های توسعه یافته شکل 3a). پس از جدا شدن از TIRAP، MyD88 اجزای اصلی میدوزوم (IRAK2 و IRAK4 (IRAK2/4)، TRAF6) را همزمان با انتقال سیگنال (p38α فسفریله شده (p-p38α) درگیر کرد؛ داده های توسعه یافته شکل 3a).

بنابراین این تجزیه و تحلیل جنبشی شواهد بیوشیمیایی برای مفهوم بلوغ میدوزوم ارائه کرد: اتصال اولیه TLR-TIRAP (یعنی تشکیل پروتو-میدوزوم)، به دنبال آن آزادسازی گیرنده و استخدام آنزیم های سیگنالینگ (یعنی بلوغ میدوزوم؛ شکل 2a).

ما کمپلکس‌های MyD88-TRAM را پس از تحریک PAMP مشاهده کردیم، که در طول انتقال پروتو-میدوزوم به میدوزوم رخ داد (شکل 2a و داده‌های توسعه یافته شکل 3a). کمپلکس های MyD88-TIRAP-TLR4 با نرخ های مشابه در سلول های WT و ∆ Ticam1 مونتاژ و جدا شدند (شکل 2a). در مقابل، سلول های ∆ Ticam2 کمپلکس های MyD88-TIRAP-TLR4 را در طول زمان حفظ کردند، که در نهایت اجزای اصلی میدوزوم را به کار گرفتند (شکل 2a و داده های توسعه یافته شکل 3a).

سلول های Δ Irak4، ∆ Irak2 و ∆ Traf6 و سلول های WT تیمار شده با zimlovisertib (مهارکننده کیناز IRAK4) یا Dynasore (مهار کننده اندوسیتوز TLR4) برهمکنش MyD88 با گیرنده، TIRAP یا TRAM را تغییر ندادند (داده های توسعه یافته شکل 3b). سطوح سطح سلولی TLR2 و TLR4 و اندوسیتوز TLR4 ناشی از LPS در سلول‌های همه ژنوتیپ‌ها بی‌تأثیر بود (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3c).

a، تجزیه و تحلیل زمان حل شده گیرنده و آداپتور (TLR4، TIRAP و TRAM) و اجزای هسته میدوزوم (IRAK2، IRAK4 و TRAF6) با MyD88. آنالیز تراکم سنجی پس از رسوب همزمان (IP) و آنالیز ایمونوبلات، همانطور که در داده های توسعه یافته شکل 3a نشان داده شده است، به عنوان درصد حداکثر ارتباط MyD88 بیان شده است. b، ایمونوبلات های رسوب ایمنی میدوزوم از MyD88-AGF WT یا ∆ Ticam2 iBMDMs تحریک شده با LPS برای زمان های مشخص شده. ستاره نشان دهنده زنجیره سنگین IgG است.

ج، تصاویر فلورسانس جابجایی هسته ای p65 پس از تحریک LPS iBMDM های WT یا TIR-adapter-KO که p65-mScarlet3 را در حضور TNFRII محلول برای مسدود کردن سیگنالینگ TNF اتوکرین بیان می کنند (سمت چپ). میله های مقیاس، 20 میکرومتر. سمت راست، نمودار فاز نسبت هسته p65 به سیتوپلاسمی (فعالیت NF-kB) در طول 12 ساعت تحریک PAMP. تجزیه و تحلیل d، e، RT-qPCR Tnf و Il6 pre-mRNA و فراوانی mRNA بالغ (d) و سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA) برای ترشح TNF و IL-6 (e) از WT یا TIR-adapter-KO iBMDMs (24MPh).

تصاویر در b و c نماینده n = 3 آزمایش هستند. داده های a میانگین از n = 3 آزمایش است. داده‌های موجود در c یک نماینده از n = 3 آزمایش را نشان می‌دهد که n = 200 سلول را در هر شرط تجزیه و تحلیل می‌کند. برای d و e داده ها میانگین ± s.e.m هستند. از n = 3 آزمایش. داده های منبع ژل در داده های تکمیلی 1 ارائه شده است.

افزایش زمان رسوب ایمنی پس از تحریک PAMP نشان داد که برهمکنش غیرعادی بین MyD88-TIRAP-TLR4 و آنزیم های سیگنال دهی پایین دست (که به طور منحصر به فرد در سلول های ∆ Ticam2 رخ می دهد) تا 6 ساعت ادامه داشت (شکل 2b). در مقابل، سلول‌های WT در عرض چند دقیقه از کمپلکس MyD88-TIRAP-TLR4 (پرتو-میدوزوم) به مجتمع MyD88-IRAK-TRAF6 (myddosome) انتقال یافتند. کمپلکس‌های MyD88 در سلول‌های ∆ Ticam2 ناپایدار بودند و متعاقبا ناپدید شدند.

در مقابل، برهمکنش‌های MyD88 با IRAK2/4 و TRAF6 برای بیش از 12 ساعت در سلول‌های WT ادامه یافت، با تعاملات TIRAP و TLR4 برای کمتر از 1 ساعت (شکل 2b).

30 تا 60 دقیقه پس از تحریک PAMP، میدوزوم‌های WT با ترکیب IKKs، TBK1 و افکتورهای انتهایی NF-κB p65 و p38α بالغ شدند (داده‌های توسعه یافته شکل 3d). اگرچه MyD88 نیز با این عوامل در سلول های ∆ Ticam2 کمپلکس هایی را تشکیل داد، اما تعاملات پیش از موعد از بین رفت و کمپلکس های MyD88 قبلا توسط تنظیم کننده اتوفاژی p62 هدف قرار گرفتند (داده های توسعه یافته شکل 3d). این داده‌ها نشان می‌دهند که TRAM با MyD88 با سینتیک‌هایی مرتبط است که با پروتئین‌های دیگر متفاوت است، و TRAM بلوغ میدوزوم را با آزاد کردن پروتو میدوزوم‌ها از گیرنده‌ها هدایت می‌کند.

ما نقش TRAM را در سیگنال‌دهی TLR با بلات ایمنی برای فعالیت‌های NF-κB (p-IKKα/β، p-p65، تخریب IκBα)، MAPKs (p-ERK1/2، p-JNK، p-p38α) و TBK1 (p-TBK1) برای فعالیت‌های تحریک 12 MPple (شکل 2 تا 12 ساعت پس از ساعت) ارزیابی کردیم. تجزیه و تحلیل تراکم سنجی و عادی سازی سلول های تیمار نشده، محاسبه امتیاز فعالیت و خروجی کل مسیر را فعال کرد (داده های توسعه یافته شکل 4a). در مقایسه با سلول‌های WT، سلول‌های ∆ Myd88 و ∆ Tirap در تمام مسیرهای ناشی از TLR بررسی‌شده معیوب بودند.

سلولهای ∆ Ticam1 به طور معمول به LTA پاسخ دادند اما فعالیت NF-κB کاهش یافته را در پاسخ به LPS نشان دادند، در حالی که فعالسازی MAPK و TBK1 بی‌تأثیر باقی ماند (داده‌های توسعه یافته شکل 4a). قابل توجه است که سلولهای ∆ Ticam2 تمام فعالیتهای القا شده با TLR را آغاز کردند، اما این فعالیتها زودتر از موعد پایان یافتند (دادههای توسعه یافته شکل 4a). خاتمه زودهنگام سیگنال در سلول های ∆ Ticam2 برای NF-κB و TBK1 مشهودتر بود، که به مدت 12 ساعت در سلول های WT فعال باقی ماندند. ما بیشتر پویایی NF-kB را با استفاده از تصویربرداری سلول زنده از گزارشگران p65-mScarlet3 در حضور TNFRII محلول برای جلوگیری از اثرات TNF اتوکرین تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 2).

2c و داده های توسعه یافته شکل 4b). نسبت p65 هسته ای: سیتوپلاسمی فعال سازی پایدار NF-kB را در سلول های WT تیمار شده با LPS نشان داد، همانطور که قبلا گزارش شده بود 21، 48، 49، در حالی که LTA فعالیت نوسانی را تحریک می کرد (شکل 2c و داده های توسعه یافته شکل 4b). سلول های Δ Myd88 و Δ Tirap تا حد زیادی برای فعال سازی NF-κB معیوب بودند (شکل 2c و داده های توسعه یافته شکل 4b). مطابق با کار قبلی 23، سلول های ∆ Ticam1 تحت درمان با LPS، یک الگوی نوسانی را نشان دادند که شبیه تحریک LTA بود. سلول های ∆ Ticam2 یک فنوتیپ منحصر به فرد را نشان دادند.

این سلول ها اولین پیک فعالیت NF-κB تقریبا طبیعی داشتند، اما نتوانستند سیگنال دهی را حفظ کنند، که نشان دهنده تضعیف سیگنال زودرس است (شکل 2c و داده های توسعه یافته شکل 4b). PCR کمی با رونویسی معکوس (RT-qPCR) تجزیه و تحلیل pre-mRNA ها و mRNA هایی که PRG Tnf و SRG Il6 را کد می کنند، الگوهای بیان مشابهی را در سلول های WT و ∆ Ticam1 نشان داد و هیچ القایی در سلول های Δ Myd88 و Δ Tirap وجود نداشت (شکل 2d). انفجارهای نوسانی Tnf pre-mRNA شناسایی شده در سلول های WT تا حد زیادی پس از اوج اولیه در سلول های ∆ Ticam2 وجود نداشت.

Il6 pre-mRNA به طور مشابه کاهش یافت، که منجر به کاهش سطوح mRNA Il6 بالغ (شکل 2d) و کاهش ترشح سیتوکین شد (شکل 2e). این اثر تا حد زیادی مستقل از TRIF بود (شکل 2e). این یافته‌ها در BMDM‌های اولیه موش‌های WT و Ticam2 -/- تأیید شد (شکل 3a-d و شکل تکمیلی 3a)، که در آن‌ها علاوه بر این، ترشح محصول SRG IL-12p40 را ارزیابی کردیم (شکل 3d).