تنظیم‌کننده‌های مکث و افزایش طول رونویسی واسطه هایپرجهش سوماتیک هستند

هیپرجهش سوماتیک (SHM) جهش‌های نقطه‌ای را در نواحی متغیر ژن‌های ایمونوگلوبولین در سلول‌های B فعال ایجاد می‌کند تا از بلوغ میل آنتی‌بادی پشتیبانی کند. SHM توسط دآمیناز ناشی از فعال سازی (AID) آغاز می شود، و تصور می شود که بستر DNA تک رشته ای این سیتوزین دآمیناز در طول رونویسی RNA پلیمراز II (PolII) ایجاد می شود، شاید در زمینه توقف PolII 2، 3. عوامل و مکانیسم‌هایی که واسطه جذب کروماتین AID می‌شوند و بستر PolII متوقف شده آن را در طول SHM ایجاد می‌کنند ناشناخته هستند.

فاکتور افزایش طول منفی (NELF) PolII را در حالت مکث در نزدیکی محل شروع رونویسی تثبیت می کند. انتشار NELF از PolII و تصمیم افزایش طول در مقابل خاتمه PolII با مخالفت با فعالیت‌های کیناز کمپلکس فوق افزایش طول (SEC) و فسفاتاز 2A (INT-PP2A) یکپارچه‌کننده-پروتئین تنظیم می‌شود. در اینجا نشان می‌دهیم که NELF، اجزای SEC MLLT1 و MLLT3 و ماژول فسفاتاز INT-PP2A برای SHM مورد نیاز هستند.

ما نشان می‌دهیم که NELF می‌تواند با PolII در پنجره هدف AID در بدن ژن مرتبط باشد و در غیاب NELF، AID علی‌رغم جذب کارآمد به کروماتین و رونویسی توسط PolII، نمی‌تواند اهداف خود را از بین ببرد. MLLT1 و MLLT3 با AID از طریق دامنه YEATS پیوند دهنده هیستون خود در تعامل هستند و برای غنی سازی AID در سایت های هدف مورد نیاز هستند. ما یک عملکرد فیزیولوژیکی برای ارتباط NELF-PolII در اجسام ژنی در ایجاد بستر متوقف شده PolII برای عملکرد AID در طول SHM پیشنهاد می‌کنیم.

مکانیسم هایی که عملکرد AID را با رونویسی PolII هماهنگ می کند، ایجاد نشده است. همچنین عواملی که SHM را به یک پنجره هدف از حدود 150 جفت باز به 2 کیلوبایت در پایین دست محل شروع رونویسی (TSS) 5، 6 محدود می کند و میانجیگری جذب AID برای اهداف فیزیولوژیکی ایمونوگلوبولین و مکان های خارج از هدف غیرایمونوگلوبولین آن را انجام می دهد (شکل 1a). پس از شروع، PolII تمایل به توقف 20-60 جفت باز در پایین دست TSS (مکث پروموتر- پروگزیمال (PPP)) دارد که توسط NELF و فاکتور القای حساسیت به DRB (DSIF؛ متشکل از SPT4 و SPT5) تثبیت شده است. 4، 7 (شکل 1b).

NELF، متشکل از زیر واحدهای A، B، C/D (ایزوفرم های تولید شده از یک ژن) و E، یک عامل توقف اختصاصی PolII است که عمدتا در TSS ها در ارتباط با PolII 8، 9، 10، 11، 12 یافت می شود. در کمپلکس متوقف شده NELF-DSIF-PolII، NELF مکث PolII را با تثبیت پیکربندی هیبرید DNA-RNA در محل فعال PolII و مهار اتصال PolII به فاکتورهای ازدیاد طول رونویسی TFIIS، SPT6 و کمپلکس PAF1 (PAF1,4) که ازدیاد طول نمی‌کشد، ترویج می‌کند.

مدل ساده شده SHM. C، منطقه ثابت؛ V، منطقه متغیر. ب، شماتیک دو سرنوشت شناخته شده برای PolII در PPP. ج , لکه دوره زمانی تخریب NELFA. کنترل، عصاره RASH-1C. مثلث باز، پروتئین ذوب شده دگرون؛ مثلث پر، پروتئین درون زا. n = 1. d، e، فرکانس‌های جهش نقطه‌ای در سلول‌های NELFA degron (d) و NELFC/D degron (e) RASH-1C تیمار شده با dTAGV-1 یا dTAGV-1 NEG به مدت 4 ساعت و 2 روز داکسی‌سایکلین (مانند سایر آزمایش‌های بدون دگرون در اینجا نشان می‌دهد).

برای تمام نمودارهای فراوانی جهش، داده ها با کم کردن پس زمینه بدون داکسی سایکلین ارائه می شوند. داده های خام و تفریق نشده در داده های منبع جدول بندی می شوند. n = 3. آنالیز واریانس (ANOVA) در d: F 1,12 = 498.0، P <0.0001. ANOVA در e: F 1،12 = 6227، P <0.0001. f، وسترن بلات سلول های RASH-1C NELFC/D دگرون (C/D-deg) و NELFA degron (A-deg). مثلث باز، پروتئین ذوب شده دگرون؛ مثلث پر، پروتئین درون زا. n = 1. g، h، فرکانس‌های جهش نقطه‌ای در سلول‌های RASH-1C NELFA degron (g) و NELFC/D degron (h) دستگیر شده با G1. n = 3. ANOVA در گرم: F 1،12 = 416.2، P <0.0001.

ANOVA در ساعت: F 1،12 = 365.8، P <0.0001. i، فرکانس‌های جهش نقطه‌ای در IGHV در سلول‌های دگرون NELFA با ناک اوت UNG (KO) یا UNG و MSH2 دو KO (UNG / MSH2 DKO). n = 3 در کنترل، n = 4 در UNG KO و n = 6 در UNG/MSH2 DKO. ANOVA: F 2,20 = 83.27، P <0.0001. j، فرکانس‌های جهش نقطه‌ای در جایگاه‌های خارج از هدف AID در سلول‌های NELFA degron UNG KO، BCL2- بیان بیش از حد با 5 روز درمان داکسی‌سایکلین. n = 3. k، فرکانس جهش نقطه ای از n = 3 کلون سلول GCB انسانی NELFA degron مستقل.

l، وسترن بلات در سلول های GCB طحال مرتب شده از Nelfb fl/+ ایمن شده. موش های AID-cre (F/+) و Nelfb fl/fl. موش های AID-cre (F/F). بارگذاری گرادیان پروتئین در Nelfb fl/+. نمونه های AID-cre نشان داده شده است. n = 2. m، فرکانس‌های جهش نقطه‌ای در سلول‌های GCB مرتب شده از Nelfb fl/+ واکسینه‌شده. موش های AID-cre و Nelfb fl/fl. موش های AID-cre. n = 3 برای Nelfb fl/+، n = 4 برای Nelfb fl/fl. داده ها میانگین ± s.d هستند. (نوارهای خطا). اهمیت: آنالیز واریانس دو طرفه با آزمون مقایسه های چندگانه (d، e، g-i)، آزمون t زوجی دو طرفه (j، m) یا آزمون t زوجی دو دنباله (k).

شماتیک های ایجاد شده در BioRender: a , Wu, L. https://biorender.com/w3gy2yg (2026)؛ b, Wu, L. https://biorender.com/crympkc (2026).

بر اساس درک کنونی، PolII در PPP دستخوش یکی از دو سرنوشت احتمالی می شود: رها شدن به طول مولد یا خاتمه 4 (شکل 1b). افزایش طول توسط P-TEFb انجام می شود و زیرواحد کیناز آن CDK9، SPT5 و دامنه کربوکسی ترمینال و ناحیه پیوند دهنده 13 RPB1 (زیر واحد بزرگ PolII) و NELF را فسفریله می کند. در نتیجه، تفکیک NELF القا می‌شود، PolII دارای ازدیاد طول بازیابی می‌شود و عوامل ازدیاد طول محدود می‌شوند.

یک منبع مهم P-TEFb فعال SEC است، یک مجموعه ناهمگن سازمان یافته در اطراف داربستی که P-TEFb و زیر واحدهای قابل تعویض MLLT1 و MLLT3 را متصل می کند (مراجعه 15، 16). خاتمه تا حدی توسط INT-PP2A انجام می شود، که می تواند باقیمانده های SPT5 و دامنه C ترمینال PolII را فسفریله کند، که از تفکیک NELF و انتشار مکث جلوگیری می کند 17، 18، 19.

اگرچه NELF کاندیدای جذابی برای میانجیگری توقف PolII در طول SHM است، محل عملکرد متعارف آن (PPP) بالادست است و با پنجره هدف AID همپوشانی ندارد. علاوه بر این، مشخص نیست که آیا یا چگونه مجتمع NELF-DSIF-PolII ناکارآمد رونویسی می تواند وارد پنجره هدف SHM شود یا خیر. یک راه حل بالقوه برای این چالش مفهومی با شناسایی یک کمپلکس NELF-DSIF-PolII "مستعد" با ازدیاد طول ارائه شد.

این کمپلکس می‌تواند TFIIS (برای راه‌اندازی مجدد رونویسی PolII در حالت عقب‌گرد یا کج‌شده 21 مورد نیاز است) اما PAF1c یا SPT6 را متصل کند. کمپلکس آماده NELF-DSIF-PolII یک منطق مکانیکی برای این یافته فراهم می کند که NELF می تواند با PolII در اجسام ژنی پس از تخلیه حاد SPT6 مرتبط شود (مرجع 9). در اینجا ما آزمایش کردیم که آیا NELF نقش مستقیمی در هماهنگی رونویسی PolII با دآمیناسیون با واسطه AID دارد یا خیر.

برای ارزیابی نقش NELF در SHM، ما متدولوژی برچسب تخریب (dTAG) 22 را با سلول‌های RASH-1C 23، 24، یک مشتق از رده سلولی لنفوم B بورکیت انسانی Ramos که دارای یک گزارشگر SHM GFP است که در زنجیره سنگین ایمونوگلوبولین ادغام شده است (IGH) ترکیب کردیم. بیش فعال AID (AID7.3) 25. پس از درمان سلول های دگرون RASH-1C با القاء کننده تخریب dTAGV-1 (یا ترکیب کنترل منفی آن (NEG)) و به دنبال القای AID داکسی سایکلین، SHM بر اساس از دست دادن فلورسانس GFP یا بیان سطح IgM اندازه گیری شد.

روش دیگر، ما توالی یابی جهش با توان بالای IGHV، ایمونوگلوبولین-λ زنجیره سبک V (IGL V) یا توالی هدف گیری هایپرجهش (HTS7) در بالادست گزارشگر GFP را انجام دادیم.

NELFA به سرعت و به طور موثر در سلول های NELFA degron RASH-1C تخریب شد (شکل 1c). علاوه بر این، از دست دادن NELFA، یا NELFC/D از سلول‌های NELFC/D دگرون، بر زنده‌مانی سلولی در روز 2 یا 3 تأثیری نداشت، با تکثیر سلولی در روز 3 (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a,b). از این رو، بیشتر آنالیزهای NELF degron در روز 2 القاء AID انجام شد. توالی یابی با توان بالا کاهش تقریبی ده برابری در تجمع جهش های نقطه ای در HTS7، IGHV و IGLV در غیاب NELFA یا NELFC/D نشان داد (شکل 1d,e).

از دست دادن NELFA یا NELFC/D منجر به کاهش سطح سایر زیرواحدهای NELF شد، همانطور که انتظار می‌رفت 8، اما نه RPB1، SPT6، SPT5 یا AID (شکل 1f). کاهش شدید مشابهی در SHM پس از 1 روز از القای AID (داده های توسعه یافته شکل 1c,d) و در سلول های متوقف شده در فاز G1 چرخه سلولی مشاهده شد (شکل 1g,h و داده های توسعه یافته شکل 1e-h). در سلول هایی که قادر به ترمیم وقایع دآمیناسیون با واسطه AID نیستند به دلیل فقدان فاکتور ترمیم پایه برش UNG یا هر دو UNG و فاکتور ترمیم عدم تطابق MSH2 (توسعه داده شکل 2).

1i)، از دست دادن NELFA منجر به کاهش قابل توجهی در جهش شد (شکل 1i و داده های توسعه یافته شکل 1j,k). در سلول‌های فاقد UNG و بیان بیش از حد BCL2 برای حفظ بقای سلول (داده‌های توسعه‌یافته شکل‌های 1i و 2a,b)، از دست دادن NELFA به طور قابل‌توجهی باعث کاهش تجمع جهش در اهداف زیر شد: جایگاه‌های ایمونوگلوبولین. چهار ژن غیر ایمونوگلوبولین که قبلا به عنوان اهداف SHM در سلول های راموس شناسایی شده بودند. و منبع بیان AID7.3، یک هدف شناخته شده SHM 24 (شکل 1j و داده های توسعه یافته شکل 2c).

نتیجه می‌گیریم که NELF برای تقریبا تمام فعالیت‌های SHM و AID در جایگاه‌های ایمونوگلوبولین و غیرایمونوگلوبولین خارج از هدف مورد نیاز است و این نقص به دلیل اثرات غیرمستقیم ناشی از پیشرفت چرخه سلولی معیوب یا تکثیر سلولی نیست.

ما خطوط اولیه سلول B مرکز ژرمینال انسانی (GCB) را مهندسی کردیم تا حاوی AID7.3 القا شده با داکسی سایکلین، یک بردار گزارشگر HTS7-GFP SHM 27 و یک کاست دگرون در انتهای C NELFA درون زا باشد. تخریب NELFA روی زنده ماندن سلول یا بیان AID تأثیری نداشت (داده های توسعه یافته شکل 2d,e) و تجمع جهش نقطه ای را تقریبا به طور کامل در HTS7، IGHV و ایمونوگلوبولین-κ V (IGKV) حذف کرد (شکل 1k). این نتیجه برای نتیجه گیری که NELF برای SHM مورد نیاز است پشتیبانی می کند.

تجزیه و تحلیل سلول‌های GCB طحال موش 7 روز پس از ایمن‌سازی، کاهش تقریبا 50 درصدی سطح پروتئین NELFB در سلول‌های Nelfb fl/fl ;AID-cre را در مقایسه با Nelfb fll+ نشان داد. سلول های AID-cre (شکل 1l). این یافته قابل مقایسه با کاهش سطح NELFB است که قبلا در سلول‌های CD8 T با استفاده از این موش‌های Nelfb fl/fl گزارش شده بود. حفظ سطوح قابل توجهی از NELFB ممکن است منعکس کننده انتخاب در برابر سلول هایی باشد که به طور کامل بیان NELFB را از دست می دهند.

کاهش دو برابری NELFB منجر به کاهش جزئی (تا دو برابر) در SHM در سه ناحیه هدف جهش ثابت شد: اینترون JH4، اینترون Jκ5 و 5'Sμ (شکل 1m). به طور قابل‌توجهی، تعداد یا فرکانس سلول‌های GCB (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2f,g) و بیان AID، RPB1، PolII که در آن RPB1 در Ser2 تکرارهای دامنه C ترمینال خود (S2P-PolII) یا SPT5 فسفریله می‌شود، تحت تأثیر قرار نگرفت (شکل 11). اگرچه این آزمایش‌های موش به خودی خود از نتیجه‌گیری قطعی پشتیبانی نمی‌کنند، نتایج با این ایده که NELF نقش مهمی در SHM دارد سازگار است.

علاوه بر SHM، AID بر روی نواحی سوئیچ IGH برای شروع نوترکیبی سوئیچ کلاس (CSR) عمل می کند، واکنشی که یک ناحیه ثابت IGH را با ناحیه دیگری جایگزین می کند تا عملکرد موثر آنتی بادی را تغییر دهد. با استفاده از کلون های NELFA degron و NELFC/D degron سلول های CH12F3، یک رده سلولی B موش که تحت CSR القایی وابسته به سیتوکین به IgA 29 قرار می گیرد، متوجه شدیم که از دست دادن NELFA یا NELFC/D CSR را 2 تا 3 برابر کاهش می دهد اما بر بیان AID تأثیری نمی گذارد. علاوه بر این، سطوح رونوشت ژرمین Sμ و Sα افزایش یافت و تکثیر سلولی و زنده ماندن آنها به خطر افتاد (داده های توسعه یافته شکل 2h-l).

افزایش سطح رونوشت ژرمین ممکن است تا حدی با حفظ آلل‌های بدون تغییر بیشتر در سلول‌های تخلیه‌شده NELF توضیح داده شود. نتیجه می‌گیریم که CSR می‌تواند در غیاب NELF، هرچند در سطوح کاهش‌یافته، رخ دهد، شاید به دلیل وجود مکانیسم‌های وابسته به توالی ناحیه سوئیچ برای توقف PolII و تولید بستر DNA تک رشته‌ای AID 30، 31، 32.

CUT&RUN-seq از NELFA نشان داد که همانطور که انتظار می رود، اتصال NELFA در نزدیکی TSS قوی ترین است (شکل 2a,b). مطابق با مطالعات قبلی 8، 10، از دست دادن حاد NELFA بر سطوح RPB1، PolII با RPB1 فسفریله شده در Ser5 از تکرارهای دامنه C ترمینال آن (S5P-PolII)، S2P-PolII، هیستون 3 با لیزین 4 تری متیلین37 یا 3H3H3H3H3H3H3H، RPB1، PolII با RPB1 فسفریله شده بود. استیله (H3K27ac) (شکل 2b). با استفاده از خوشه‌بندی k-means بدون نظارت، ما قبلا چهار خوشه از ژن‌ها را بر اساس سطوح اشغال PolII و همولوگ فاکتور افزایش طول 1 (ELOF1) تعریف کردیم.

ما خوشه 1 را در کل سنتز PolII، S5P-PolII، S2P-PolII و RNA بالا شناسایی کردیم و حاوی بیشتر ژن های هدف AID بود 24. ژن های خوشه 1 و IGHV، گزارشگر GFP و IGLV تغییرات کمی در سطوح PolII یا تغییرات هیستون پس از از دست دادن NELF نشان دادند (شکل 2c و داده های توسعه یافته شکل 3a,b). توالی‌یابی رونوشت‌های گذرا نرمال‌شده با اسپایک با «شیمی تایم‌لپس» (TT-TimeLapse-seq) 33 کاهش تقریبی 25 درصدی را در فعالیت ازدیاد طول رونویسی پس از 2 روز بدون NELFC/D نشان داد (شکل 2d).

این کاهش در خوشه 1 و ژن‌های کوتاه‌تر مشهودتر بود و در HTS7-GFP و IGHV معنی‌دار بود، اما نه در IGLV یا سه مورد از پنج مکان هدف غیرایمونوگلوبولین SHM (شکل 2e,f و داده‌های توسعه یافته شکل 3c-f). این یافته نشان داد که رونویسی قوی در مکان‌های هدف AID در غیاب NELF وجود دارد. ما به این نتیجه رسیدیم که کاهش فعالیت اتصال یا رونویسی PolII بعید است که عوامل اصلی در فرسایش تقریبا کامل SHM باشد که با از دست دادن NELF همراه است.

a، نقشه حرارتی CUT&RUN-seq NELFA از سلول های دگرون NELFA که با NEG یا dTAGV-1 تیمار شده اند به مدت 4 ساعت و 2 روز داکسی سایکلین (داکس) (مانند سایر آزمایش های دگرون در این شکل). TSS، سایت شروع رونویسی؛ TES، سایت پایان رونویسی. سه تکرار بیولوژیکی برای قطعات ادغام شدند. b، نمودارهای متاژن CUT&RUN-seq سلول های NELFA degron RASH-1C. سه تکرار بیولوژیکی برای کرت ها ادغام شدند. c، مرورگر ژنوم داده های CUT&RUN-seq IGH-VDJ و گزارشگر GFP را ردیابی می کند. d، مشخصات متاژن TT-TimeLapse-seq در سلول‌های دگرون NELFC/D.

سه تکرار بیولوژیکی برای کرت ها ادغام شدند. e، تعداد خواندن TT-TimeLapse-seq عادی شده است. n = 3. داده ها میانگین ± s.d هستند. (نوارهای خطا). اهمیت: آزمون t غیر جفت نشده چند دم. f، مسیرهای مرورگر ژنوم TT-TimeLapse-seq در مناطق IGH و IGL. پروفایل های g، h، AID CUT&RUN-seq در ژن های هدف AID (g) و پنجره مرورگر اتصال AID در جایگاه های IGH و IGL (h) در سلول های دگرون NELFA. n = 2. i، بالا، شماتیک NELFA انسانی. فلش ها تعاملات دامنه و IDR را نشان می دهد.

S/T، ناحیه ای حاوی ده سایت فسفوریلاسیون سرین/ترئونین (S225، T227، S230، S233، T235، T239، S244، T246، T277 و T297). پایین، ضد رسوب ایمنی بخش هسته ای سلول های NELFA degron RASH-1C که با ناقل خالی (EV) یا WT برچسب گذاری شده با پرچم یا NELFA جهش یافته بازسازی شده و با dTAGV-1 به مدت 4 ساعت و 1 روز داکسی سایکلین درمان شده است. ستاره، سیگنال پس زمینه از یک زنجیره سنگین آنتی بادی. n = 1. j، فرکانس های جهش نقطه ای در IGHV در سلول های NELFA degron RASH-1C بازسازی شده با WT یا NELFA جهش یافته. n = 3. داده ها میانگین ± s.d هستند. (نوارهای خطا).

اهمیت: ANOVA دو طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی: F 5,24 = 14.24، P <0.0001. k، نمودار متاژن CUT&RUN-seq NELFA در چهار خوشه ژنی (C1-C4) در سلول‌های NELFA degron RASH-1C. سه تکرار بیولوژیکی برای کرت ها ادغام شدند.

CUT&RUN-seq of AID نشان داد که از دست دادن NELFA تقریبا هیچ تأثیری بر اتصال AID در ژن های هدف AID به طور کلی یا در IGH ​​و IGL ندارد (شکل 2g,h و داده های توسعه یافته شکل 3g). نتیجه می گیریم که در غیاب NELF، AID به شدت متصل می شود اما نمی تواند اهداف خود را علیرغم طولانی شدن رونویسی از طریق مناطق هدف از بین ببرد.

در آزمایش‌های بازسازی، حذف حوزه برهمکنش PolII NELFA (Δ188-276) یا جهش فسفومیمتیک ده محل فسفوریلاسیون S/T P-TEFb به D (جهش STD) رسوب ایمنی S5P-PolII با فعالیت NELFA و NELFA را به خطر انداخت. در مقابل، حذف ناحیه بی نظم ذاتی (ΔIDR) یا جهش ده محل فسفوریلاسیون به A (جهش یافته STA) انجام نشد (شکل 2i،j و داده های توسعه یافته شکل 4a-c). جهش‌یافته‌های NELFA (Δ188-276) و NELFA (STD) SHM را حتی زمانی که NELFA درون‌زا تخریب نشده بود، سرکوب کردند (شکل 2j و داده‌های توسعه‌یافته شکل.

4b,c , teal bars)، که نشان داد جهش‌یافته‌های NELFA قادر به تعامل با PolII نیستند، می‌توانند اثرات منفی غالب بر SHM اعمال کنند. این نتایج نشان می‌دهد که NELFA باید PolII را برای پشتیبانی از SHM متصل کند و تقلید فسفوریلاسیون گسترده P-TEFb NELFA برهم‌کنش NELFA-PolII را مختل کرده و SHM را به خطر می‌اندازد.

اتصال NELFA به PPP محدود نمی‌شود، اما در عوض در بدن IGHV، گزارشگر GFP، IGLV، جایگاه‌های خارج از هدف AID7.3، BCL6 و RUBCNL و به طور کلی در ژن‌های خوشه 1 که به طور متوسط کوتاه‌تر از سایر ژن‌ها هستند، به راحتی قابل تشخیص است. 4e–j). در مقابل، خوشه‌های 2 و 3 که اکثر ژن‌های فعال را در بر می‌گیرند، قله تیز متعارف NELF را در نزدیکی TSS نشان دادند (شکل 2k و داده‌های توسعه‌یافته شکل 4k,l).

نتیجه می‌گیریم که NELF به طور گسترده، از جمله در پنجره هدف AID، در ایمونوگلوبولین و بسیاری از جایگاه‌های هدف غیرایمونوگلوبولین SHM توزیع شده است.

MLLT1 و MLLT3 شرکای مجاورتی AID هستند 34 و از نظر توالی در دامنه YEATS آمینو ترمینال خود که دم های هیستون آسیله شده و دامنه همسانی ANC1 ترمینال C (AHD) را که با فاکتورهای داربست SEC 16 در تعامل است، به هم مرتبط هستند (شکل 3a). سلول های MLLT1 degron RASH-1C تیمار شده با dTAGV-1 تخریب سریع MLLT1 و زنده ماندن و تکثیر سلولی بالا را برای حداقل 5 روز نشان دادند. علاوه بر این، آنها تنظیم مثبت سطوح پروتئین MLLT3 را نشان دادند، همانطور که قبلا گزارش شده بود 35، و هیچ تغییر قابل تشخیصی در سطوح AID یا سایر عوامل آزمایش شده مشاهده نشد (شکل 3b،c و داده های توسعه یافته شکل 5a).

تخریب MLLT1 منجر به افزایش زیادی در اشغال کروماتین MLLT3، به ویژه در اهداف AID، و افزایش SHM ​​در IGHV، IGLV و AID7.3 شد اما کاهش در HTS7 (مرجع 24) شد (شکل 3d-f و داده های توسعه یافته، شکل 5). خروجی رونویسی به طور قابل تشخیص با از دست دادن MLLT1 تغییر نکرد (داده های توسعه یافته شکل 5d,e). این داده ها نشان می دهد که MLLT1 برای SHM ضروری نیست و احتمال وجود عملکرد اضافی بین MLLT1 و MLLT3 در SHM را نشان می دهد.