ناهمگونی اپی ژنتیک در تومورهای پستان، تشخیص و پیش آگهی را نشان می دهد

سرطان سینه که بیشترین سرطان تشخیص داده شده در بین زنان است، توسط الگوهای بیان ژن به زیرگروه های مجرای و پایه مانند طبقه بندی می شود و دومی با پیش آگهی بدتری همراه است 1، 2، 3. پیشرفت‌های اخیر در فناوری‌های تک سلولی بر وجود ناهمگونی درون توموری تأکید کرده است که چالش‌های اساسی در درمان سرطان و دستیابی به بقای طولانی‌مدت عاری از بیماری ایجاد می‌کند 4، 5، 6، 7. در اینجا ما به طور گسترده ناهمگنی اپی ژنتیکی را در گروهی از تومورهای مجرای انسانی ساده و بی‌درمان، که مستقیما پس از برداشتن جراحی به‌دست آمدند، بررسی می‌کنیم.

با استفاده از یک رویکرد اپی ژنتیک تک سلولی مبتنی بر سیتومتری بر اساس زمان پرواز، ما یک زیرجمعیت عودکننده سلول‌های پایه‌مانند در تومورهای مجرا با امضای اپی ژنتیک حفظ‌شده در بین بیماران شناسایی می‌کنیم. این سلول‌های پایه‌مانند، که با دکانولوشن الگوهای متیلاسیون DNA کل ژنوم نیز شناسایی می‌شوند، با بیان بالای صفات انکوژنیک تهاجمی و کاهش سیگنال‌دهی گیرنده‌های هورمونی مشخص می‌شوند.

مقایسه مستقیم پروفایل تک سلولی پروتئومی و ژنومی مونو متیلاسیون و تری متیلاسیون هیستون 3 بر روی لیزین 4 نشان داد که این علائم ویژگی های کلیدی مرتبط با از دست دادن هویت مجرا هستند. در نهایت، ما پتانسیل پروفایل تک مولکولی همزمان تغییرات هیستون بر روی نوکلئوزوم‌های بدون سلول در خون را به عنوان یک رویکرد بیوپسی مایع اپی ژنتیک برای تشخیص زودهنگام سرطان پستان برجسته می‌کنیم. علاوه بر این، امضای پایه اپی ژنتیک اندازه‌گیری شده در خون با پیش آگهی مرتبط است، که شناسایی بیمارانی را که در معرض خطر عود بیماری هستند، امکان‌پذیر می‌سازد.

پروفایل های بیان ژن، سرطان های سینه را به زیرگروه های A یا مجرای B (گیرنده هورمون مثبت (HR + ))، HER2 مثبت و زیرگروه های بازال طبقه بندی می کند. در این میان، زیرگروه‌های پایه‌مانند تا حد زیادی با سرطان پستان سه‌گانه منفی (TNBC) همپوشانی دارند. این طبقه بندی ها مدیریت درمان و پیش آگهی را راهنمایی می کند. سرطان سینه + HR لومینال به طور کلی به درمان غدد درون ریز با نتایج مطلوب پاسخ می دهد، با این حال بسیاری از بیماران عود می کنند 8 .

مطالعات تک سلولی و فضایی ناهمگونی درون توموری قابل توجهی را در میان زیرگروه‌ها نشان داده‌اند که به طور بالقوه باعث مقاومت در برابر درمان و عود آن می‌شود 4، 5، 6، 7، 9.

سازمان کروماتین، با واسطه DNA و تغییرات پس از ترجمه هیستون (PTMs)، کسب حالات سلولی متمایز اپی ژنتیکی در سلول های ژنتیکی یکسان را تسهیل می کند. اگرچه توالی یابی RNA تک سلولی (scRNA-seq) و توالی یابی کروماتین-دسترسی تک سلولی (scATAC-seq) ناهمگونی درون توموری را مشخص می کند 13، 14، 15، 16، سهم الگوهای کروماتین نامشخص است 17.

پروفایل تک سلولی علائم هیستون، مانند تری متیلاسیون هیستون 3 بر روی لیزین 27 (H3K27me3)، حالت های کروماتین را در ناهمگونی تومور پستان و مقاومت درمانی دخیل می کند 18، 19. با این حال، این روش‌ها تعداد محدودی از علائم کروماتین را اندازه‌گیری می‌کنند، که مانع از تجزیه و تحلیل الگوها و برهمکنش‌های پیچیده می‌شود. ما یک روش سیتومتری با استفاده از زمان پرواز (CyTOF) ایجاد کردیم تا به طور سیستماتیک چندین PTM هیستون را نمایان کنیم و الگوهای کروماتین خاص جمعیت را برای بررسی ناهمگنی بین سلول‌های سرطانی بررسی کنیم.

حالت های اپی ژنتیک تومور نیز در خون منعکس می شود. نوکلئوزوم‌های بدون سلول، در گردش پلاسما، که عمدتا توسط سلول‌های طبیعی و سرطانی در حال مرگ آزاد می‌شوند، الگوهای اپی ژنتیکی بافت منشأ را حفظ می‌کنند. پلت فرم تصویربرداری تک مولکولی ما، اپی ژنتیک نوکلئوزوم های جدا شده از پلاسما (EPINUC)، ویژگی های اپی ژنتیکی متعددی را بر روی نوکلئوزوم های پلاسما ثبت می کند. این روش سرطان کولورکتال، از جمله بیماری در مراحل اولیه با بار کم را شناسایی می‌کند، و پروفایل مولکولی با حداقل تهاجم و نظارت بر درمان تومورهای مغزی کودکان را امکان‌پذیر می‌سازد.

در اینجا ما یک تجزیه و تحلیل اپی ژنتیکی کل نگر از تومورهای پستان بدون درمان اولیه و نوکلئوزوم‌های بدون سلول خونی ارائه می‌کنیم. پیوند الگوهای اپی ژنتیک داخل توموری مکرر به نوکلئوزوم های در حال گردش، ناهمگنی اپی ژنتیک تومور را با پیامدهای بالینی بالقوه آن مرتبط می کند. این کار تغییرات اپی ژنتیکی را به‌عنوان واسطه‌های کلیدی ناهمگونی درون توموری و نشانگرهای زیستی بالقوه برای تشخیص زودهنگام و پیش‌آگهی نشان می‌دهد.

برای ارزیابی ناهمگونی در تغییرات هیستون تومور پستان، ما CyTOF متمرکز بر اپی ژنتیک را بر روی تومورهای تازه و جراحی برداشته شده از زنان ساده لوح انجام دادیم و تغییرات هیستون را در وضوح تک سلولی اندازه‌گیری کردیم (شکل 1a و جدول تکمیلی 1). گروه عمدتا شامل تومورهای HR + مجرا و تنها یک تومور پایه سه گانه منفی (TN, HR -) بود (12=n؛ جدول تکمیلی 2 و شکل تکمیلی 1a,b)، زیرا درمان نئوادجوانت استاندارد اکثر موارد TN را از واجد شرایط بودن درمان حذف کرد.

پس از اصلاح دسته ای و نرمال سازی، تجزیه و تحلیل تقریب منیفولد یکنواخت و طرح ریزی (UMAP) همه 12 تومور نشان داد که سلول های تومور عمدتا مناطق خاص بیمار را اشغال می کنند، در حالی که سلول های استرومایی در بین بیماران با هم جمع شده اند. این نتیجه با مطالعات قبلی که تفاوت‌های ژنومی تک سلولی را اندازه‌گیری می‌کردند مطابقت دارد (شکل 1b، روش‌ها و شکل تکمیلی 2a). همپوشانی نسبی در میان سلول‌های تومور مجرای بیماران مختلف احتمالا منعکس‌کننده برنامه‌های اپی ژنتیکی خاص دودمان مشترک است.

همانطور که انتظار می رفت، سلول های استرومایی ویمنتین و αSMA را بیان کردند، در حالی که سلول های تومور کراتین های اپیتلیال، EpCAM و E-cadherin را بیان کردند (شکل 1b,c و شکل تکمیلی 2b,c). قابل توجه است که تومور پایه TN با تومورهای HR + متفاوت است و بیان کم نشانگر مجرای GATA3 و بیان بالای نشانگر پایه سیتوکراتین-5 (K5؛ همچنین به عنوان KRT5 شناخته می شود) و نشانگرهای ویمنتین مزانشیمی (شکل 1b,c و شکل تکمیلی 2d) را نشان می دهد. الگوهای کروماتین استرومال و تومور نیز متفاوت بودند، نتیجه ای که بر نقش آنها در تعیین هویت سلولی تأکید می کند (شکل 1d و شکل تکمیلی 2e).

تجزیه و تحلیل CyTOF از MCF7 (مجله) و چهار رده سلولی TN مانند پایه تأیید کرد که الگوهای بیان GATA3 و K5 می‌توانند هویت‌های مجرای و بازال را متمایز کنند. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل SHAP 30، 31 این دو نشانگر را به عنوان قوی ترین تمایز دهنده های نوع تومور شناسایی کرد (شکل 1e,f). با استفاده از چندین نشانگر هویت سلولی، ما امضای مجرای PermCell (روش ها) را به دست آوردیم که به دقت هویت خطوط سلولی را متمایز می کرد (شکل 1g).

الف، شماتیک آزمایش. تومورها جدا شدند، از سلول های ایمنی CD45 + خالی شدند، با آنتی بادی های کونژوگه فلزی رنگ آمیزی شدند و توسط CyTOF آنالیز شدند (جدول تکمیلی 1). Ac، استیلاسیون؛ من، متیلاسیون; Ub، Ubiquitination. b، UMAP مجموعه داده CyTOF (1،157،765 سلول، n = 12 تومور، میانگین 96،480 سلول در هر تومور؛ جدول تکمیلی 3). حدود 1000 سلول در هر نمونه (یک تکرار در هر تومور)، رنگ آمیزی شده با نمونه (چپ) یا شدت نشانگر (راست) نشان داده شده است. خطوط بریده بریده نشان دهنده HR +، TN و مناطق سلولی استرومایی است.

c، d، نقشه های حرارتی میانگین سطوح نشانگر در استروما، تومور TN (n = 1) و تومورهای مجرا (n = 11). ردیف ها استاندارد و خوشه بندی شده اند. e , UMAP رده های سلولی سرطان پستان. نشان داده شده است 5000 سلول در هر خط، رنگ شده توسط خط (چپ) یا شدت نشانگر (راست). f، طبقه‌بندی‌کننده XGBoost که خطوط سلولی شبه مجرا و پایه‌ای را با استفاده از همه نشانگرهای هویت سلولی جدا می‌کند (جدول تکمیلی 1). نمرات SHAP اهمیت ویژگی را نشان می دهد. g، UMAP مانند e، رنگ شده با امتیاز امضای مجرای مشتق شده از نشانگرهای نشان داده شده (پایین). ستاره نشانگرهایی را نشان می دهد که در پانل خط سلولی وجود ندارند.

h، UMAP سلول‌های تومور 5 (نماینده 11=n) به دنبال خوشه‌بندی DBSCAN و حذف نویز (سلول‌های طبقه‌بندی‌نشده)، رنگ‌آمیزی بر اساس زیرجمعیت، شدت نشانگر و امضای مجرا. i , Heatmap میانگین سطوح نشانگر در هر زیرجمعیت بر حسب h , ردیف به عنوان z-scores استاندارد شده است. سطرها و ستون ها خوشه بندی شده اند. j، UMAP از دو مدل PDX مجرا، رنگی مانند h. برای PDX-1، شش تومور به طور مساوی برای مطابقت با تعداد سلول های PDX-2 نمونه برداری شد. k، l، میانگین سطوح CyTOF Ki-67 در مقابل درصد سلول های Ki-67 + توسط IHC (k) یا سلول های چرخشی توسط امضای اپی ژنتیک (l، n = 11).

داده ها تناسب خطی (خطوط)، فواصل اطمینان 95٪ (CI، خاکستری)، r پیرسون و مقادیر P دو طرفه را نشان می دهد. تومور 20 سطوح پرت CyTOF Ki-67 را نشان داد و از مطالعه خارج شد. خوشه‌بندی m، n، UMAP و DBSCAN سلول‌های والدین MCF7 (m) و یک کلون مشتق از تک سلولی (n، کلون 5، با استفاده از تنها ویژگی‌های اپی ژنتیک، رنگ‌بندی شده در h). در یک ایجاد شده در BioRender، N. https://biorender.com/twf1psb (2026).

ما در مرحله بعد ناهمگونی درون توموری را بررسی کردیم و بر روی سلول‌های سرطانی هر تومور سینه مجرای مجزا تمرکز کردیم. خوشه‌بندی UMAP و خوشه‌بندی فضایی مبتنی بر چگالی برنامه‌های کاربردی با نویز (DBSCAN) در همه ویژگی‌ها سه زیرجمعیت را در هر تومور نشان داد که ما آن‌ها را چرخه‌ای، مجرای و پایه‌مانند نامیدیم (شکل 1h,i و داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a,b). این زیرجمعیت‌ها همچنین در دو مدل مختلف زنوگرافت مشتق از بیمار مجرا (PDX) حفظ شدند.

این یافته ناهمگونی مشاهده شده را به عنوان یک ویژگی ذاتی تومورهای سینه مجرا تایید می کند و آلودگی سلول های طبیعی را رد می کند (شکل 1j و داده های توسعه یافته شکل 1c). سلول‌های MCF7 ناهمگنی مجرای و پایه‌مانند مشابهی را نشان دادند، اگرچه اکثر سلول‌ها همانطور که برای یک رده سلولی انتظار می‌رفت در حال چرخش بودند (داده‌های توسعه یافته شکل 1d). در تومورها، فقط یک زیرمجموعه مجرا چرخه و سطوح بالایی از Ki-67 را بیان می‌کند، که نتیجه‌ای مطابق با مطالعات قبلی ایمونوهیستوشیمی (IHC) و scRNA-seq 14، 32 است. سطوح CyTOF Ki-67 با تخمین های پاتولوژی همبستگی داشت (شکل 1k).

سلول‌های چرخه‌ای همچنین سطوح بالایی از تغییرات کروماتین متعدد را، هم در اندازه‌گیری‌های خام و هم به دنبال عادی‌سازی به هیستون‌های هسته نشان دادند (شکل 1i، داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a-c و شکل تکمیلی 3). ما این نتیجه را با تکرار تجزیه و تحلیل CyTOF دو تومور (14 و 18)، با اضافه کردن نشانگر چرخه سلولی ثابت فسفو-Rb (pRb) تأیید کردیم. سلول‌های مثبت pRb افزایش در هیستون‌های هسته را نشان دادند، همانطور که از سلول‌های چرخه‌ای انتظار می‌رفت، و افزایش بیشتری در PTMs هیستونی نشان دادند (شکل تکمیلی 3).

بر این اساس، کسر دوچرخه سواری استنباط اپی ژنتیکی به شدت با سطوح Ki-67 همبستگی دارد (شکل 1l).

اکثر سلول‌های سرطانی به شدت GATA3 را بیان می‌کنند و امتیاز بالایی برای امضای مجرا، مطابق با طبقه‌بندی بالینی (شکل 1h، داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a,b و شکل تکمیلی 4a) کسب می‌کنند. علاوه بر این، در هر تومور، نمونه‌های PDX و سلول‌های MCF7، ما یک زیرجمعیت عودکننده جزئی را شناسایی کردیم که هویتی شبیه پایه به دست آورد، با بیان K5 بالا و کاهش امضای مجرا (شکل 1h-j، داده‌های توسعه‌یافته شکل 1 و شکل تکمیلی 4a). این تنوع فنوتیپی با مطالعات قبلی تک سلولی تومورهای سینه انسان و موش مطابقت دارد 14، 21، 33، 34.

شایان ذکر است، سلول‌های مجرای و پایه‌مانند نیز دارای نشانه‌های PTM هیستونی متمایز بودند (شکل 1h-j و داده‌های توسعه‌یافته شکل 1). بر این اساس، نمودارهای UMAP صرفا بر اساس اصلاحات هیستون، جدایی از زیرجمعیت‌ها را نشان داد که اساس اپی ژنتیکی این تنوع فنوتیپی را تأیید کرد (شکل تکمیلی 4b). در سلول‌های MCF7، UMAP اپی ژنتیک و خوشه‌بندی به طور مشابه چندین خوشه، از جمله یک جمعیت پایه‌مانند K5 hi را شناسایی کردند (شکل 1m).

این سلول‌های پایه‌مانند با کاهش سیگنال‌دهی مجرا در فضای UMAP به رده‌های سلولی TN نزدیک‌تر ظاهر می‌شوند، که پشتیبانی بیشتری برای هویت پایه‌مانند آنها فراهم می‌کند (شکل تکمیلی 4c). آزمایش‌های مستقل CyTOF، کشت سلول‌های والدینی MCF7 اضافی و جمعیت‌های مشتق‌شده از کلون‌های تک سلولی مستقل، الگوهای زیرجمعیت مشابهی را نشان دادند، نتیجه‌ای که بر خلاف مبنای ژنتیکی این اثرات استدلال می‌کند (شکل 1n و داده‌های توسعه‌یافته شکل 2a-c).

علاوه بر این، تومورهای PDX منفرد که از یک اهداکننده مشتق شده و به طور مستقل در موش‌های مختلف رشد کرده‌اند، نسبت‌های زیرجمعیت مشابهی را نشان می‌دهند که از یک رابطه پویا و پلاستیکی بین حالت‌های سلولی پشتیبانی می‌کند (داده‌های توسعه یافته شکل 2d). به طور کلی، داده‌های ما ناهمگنی درون توموری ذاتی را در تومورهای مجرا، با تنوع اپی ژنتیکی بین زیرجمعیت‌های مجزا نشان داد.

ما بیشتر ویژگی‌های زیرجمعیت‌های دوچرخه‌سواری، مجرا و پایه‌مانند را بررسی کردیم. خوشه‌بندی بدون نظارت، زیرجمعیت‌های متناظر را در بین بیماران گروه‌بندی کرد که استحکام و شباهت آنها را تأیید کرد (شکل 2a). در سراسر تومورها، سلول های مجرا گیرنده های استروژن (ER)، GATA3 و سیتوکراتین-8 و سیتوکراتین-18 را بیان کردند (K8/18؛ همچنین به ترتیب KRT8 و KRT18 نیز شناخته می شوند)، در حالی که سلول های بازال این نشانگرهای مجرا و K5 را به شدت بیان می کنند (شکل 2).

از آنجایی که این زیرجمعیت‌ها الگوهای کروماتین متمایز و حفاظت‌شده را نیز نشان می‌دهند، ما یک الگوریتم یادگیری ماشینی را برای پیش‌بینی طبقه‌بندی درون توموری اعمال کردیم. در هر تومور، مدلی که روی یک زیرمجموعه تصادفی آموزش دیده بود، سلول‌های باقی‌مانده را با دقت 94 درصد پیش‌بینی می‌کرد، که تفاوت‌های قوی بین زیرجمعیت‌ها را تأیید کرد (شکل 2c و داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a). همچنین 78 درصد از سلول‌های «نویز» خوشه‌نشده را با اطمینان بیش از 95 درصد اختصاص داد، و طبقه‌بندی‌هایی را ایجاد کرد که با موقعیت‌های خوشه‌بندی اولیه و UMAP همسو بودند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3b).

تجزیه و تحلیل SHAP ویژگی های محرک هر زیرجمعیت را شناسایی کرد. به طور جزئی، PTM های هیستون، به ویژه چهار علامت استیلاسیون، علیرغم همپوشانی علائم فردی با سلول های پایه مانند، پیش بینی کننده های اصلی سلول های چرخشی بودند (داده های توسعه یافته شکل 3c,d). H3K27me3 و H2Aub مرتبط با Polycomb نیز به ویژگی‌ها کمک کردند، یافته‌ای که با تنظیم‌زدایی Polycomb و فعالیت پیش‌پرولیفراتیو قبلا مشاهده‌شده در سرطان سینه مطابقت دارد.

a، سه زیرجمعیت از هر تومور HR + (n = 14، شامل 3 تکرار لنگر؛ جدول تکمیلی 3) توسط ویژگی‌های CyTOF خوشه‌بندی شده‌اند. دندروگرام الگوهای عود کننده را در بین بیماران نشان می دهد. ب، نقشه حرارتی میانگین تفاوت‌های نشانگر هویت سلولی بین زیرجمعیت‌های پایه‌مانند و مجرا (14=n، مانند a). ج، ماتریس سردرگمی پیش‌بینی‌های XGBoost زیرجمعیت‌ها (HR + تومور، n = 14). سطرها در هر کلاس واقعی با دقت 94% نرمال می شوند. d، نمرات SHAP برای سهم ویژگی در طبقه بندی پایه مانند در مقابل مجرا، به ترتیب نزولی رتبه بندی می شود. دقت XGBoost = 92%.

e , Heatmap مانند b از PTM های هیستونی متمایز برتر نشان داده شده در d . ردیف ها خوشه بندی می شوند. f، نمودارهای UMAP تومورهای 4 و 5، مدل‌های PDX مجرا (n = 2) و سلول‌های MCF7، رنگ‌شده با امضای اپی ژنتیکی شبیه پایه (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4a). خط چین نشان دهنده جمعیت قاعده مانند است. g، درصد سلول‌های پایه‌مانند در تومورهای HR + طبقه‌بندی شده با زیرگروه A مجرای A (n = 7) یا مجرای B (n = 4). جعبه ها: میانه و صدک 25-75; سبیل ها 1.5× محدوده بین چارکی (IQR) را نشان می دهند. و نقاط تومورهای فردی هستند. آزمون مجموع رتبه دو طرفه ویلکاکسون.

h، درصد سلول های پایه مانند در مقابل بار جهش تومور (n = 11). داده ها تناسب خطی (خط)، 95% CI (سایه زنی خاکستری)، ρ Spearman و مقدار P دو طرفه را نشان می دهد. i، سطوح نشانگرهای هویت مجرا در سلول های K5 hi و K5 کم از تومور 19. نقاط نشان دهنده شدت پروتئین (log 2) در تکرارهای فنی 200 سلول مرتب شده (6-7 چاه در هر جمعیت) است. آزمون t دو طرفه ولش، بدون تعدیل برای مقایسه های چندگانه. j، نمودار آتشفشانی تفاوت بیان پروتئین بین سلول های K5 hi و K5 کم، همانطور که در i. محورها تفاوت شدت پروتئین و -log 10 [P] را نشان می‌دهند.

مقادیر P (آزمون های t دو طرفه Student) با نرخ کشف کاذب (FDR) تصحیح شد. سبز و صورتی پروتئین‌ها را به‌طور قابل‌توجهی تنظیم‌شده نشان می‌دهند (تغییر برابر > 1.5، q <0.05). پروتئین های نشاندار دارای تغییر برابری بیش از 2 هستند و با عبارت های غنی شده در k مطابقت دارند. k , l , غنی سازی عملکردی پروتئین ها به طور قابل توجهی تنظیم مثبت تعریف شده در j . k ، شرایط مشخصه MSigDB. l، دودمان سلول های اپیتلیال پستانی (MEC) 50 (جدول تکمیلی 4a). اصطلاحات با P <0.05 اسمی نشان داده شده است (آزمون هایپرهندسی یک طرفه). اندازه نقطه نشان دهنده همپوشانی پروتئین ها، رنگ -log 10 [P] است.

m، بیان پروتئین CD74 همانطور که در i. سلول‌های n-o، MCF7 بر اساس سطوح CD74 طبقه‌بندی شدند و برای مهاجرت Transwell به سمت FBS و EGF (n) یا بهبود زخم (o)، با استفاده از n = 3 جمعیت طبقه‌بندی شده به طور مستقل از همان آزمایش مورد سنجش قرار گرفتند. برای o، مساحت شکاف نسبت به روز 0 کمی سازی شد. داده ها میانگین ± s.e.m. نقطه ها تکرار را نشان می دهند. آزمون t دو طرفه Welch’s, Holm-corrected.

جداسازی لومینال و قاعده‌مانند به طور مشابهی اپی ژنتیکی رانده می‌شد، با علائم H4K20me3، H3K36me3 و H3K9me2 بالاترین امتیازات SHAP را داشتند (شکل 2d). در سراسر تومورها، سلول های بازال مانند به طور مداوم تک متیلاسیون و تری متیلاسیون H3K9me2 و H3K4 را افزایش دادند، در حالی که سلول های مجرا علائم H4K20me3، H3K36me3، H3K9me3 و H3K27me3 را افزایش دادند (شکل 2e). این نتایج با امضاهای هیستون PTM مرتبط با زیرگروه 39 و نقش گزارش شده برای دمیلازهای H3K4، مانند JARID1B، در انتقال مجرای-پایه ای مطابقت دارد.

هر دو سلول مجرا و شبه پایه توزیع pRb مشابهی را نشان دادند، که از این نتیجه گیری پشتیبانی می کند که این نتایج به جای تفاوت های چرخه سلولی، حالت های سلولی متمایز را منعکس می کند (داده های توسعه یافته شکل 3e). امضاهای اپی ژنتیک مشابه، جمعیت های مجرا و پایه مانند را در مدل های PDX متمایز می کند (داده های توسعه یافته شکل 3f). بر این اساس، PermCell بازال-مانند فقط اپی ژنتیک به طور دقیق سلول های بازال-مانند گرفته شده را در تومورها، سلول های PDX و MCF7 امتیاز می دهد (شکل 2f و داده های توسعه یافته شکل 4).

به طور کلی، چارچوب محاسباتی ما تأیید می‌کند که ناهمگنی اپی ژنتیکی مکرر در تومورهای HR + پستان وجود دارد و الگوهای کروماتین مرتبط با سلول‌های K5 hi مانند پایه وجود دارد.

مطابق با نتایج CyTOF، تومورهایی با کسرهای بالاتری از سلول‌های پایه‌مانند تعریف‌شده اپی ژنتیک، سلول‌های مثبت ER و گیرنده پروژسترون (PR) مثبت کمتری داشتند، همانطور که توسط IHC اندازه‌گیری شد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5a,b و جدول تکمیلی 2). سلول های بازال مانند در تومورهای مجرای B با پیش آگهی بدتر از تومورهای A مجرای فراوان تر بودند. این نتیجه با مطالعاتی مطابقت دارد که نشان می‌دهد این تومورها ویژگی‌های مشترک با زیرگروه پایه‌مانند 3، 41، 42، 43 را نشان می‌دهند (شکل 2g).

اگرچه بار جهش تومور در سراسر گروه کم بود، اما با بخش شبه پایه تعریف شده توسط CyTOF همبستگی مثبت داشت، که موازی با بی ثباتی ژنومی بیشتر است که معمولا با TNBC 44، 45 مرتبط است (شکل 2h و جدول تکمیلی 2). تومورهای جهش یافته TP53 نیز حاوی سلول‌های پایه‌مانند بیشتری هستند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5c)، یافته‌ای که یادآور مطالعات تک سلولی گلیوبلاستوما است که نشان می‌دهد جهش‌های ژنتیکی ممکن است بر تعادل بین حالت‌های سلولی تأثیر بگذارد.

به طور کلی، این ارتباط بین ویژگی‌های پاتولوژیک و مولکولی، زیرجمعیت پایه‌مانند متمایز اپی ژنتیکی را به یک فنوتیپ بیماری تهاجمی‌تر مرتبط می‌کند.

برای مشخص کردن عملکرد این سلول‌ها، ما FACS را برای مرتب‌سازی سلول‌ها از تومور 19 و سپس طیف‌سنجی جرمی با ورودی کم انجام دادیم. پس از حذف استروما از طریق رنگ‌آمیزی پان سیتوکراتین، سلول‌ها بر اساس سطوح K5 طبقه‌بندی شدند تا سلول‌های پایه‌مانند در مقایسه با جمعیت مجرا غنی شوند. سلول های کم K5 نشانگرهای مجرا و پروتئین های مرتبط با سیگنال دهی استروژن را به شدت بیان می کنند، در حالی که سلول های K5 hi مانند پایه پروتئین های درگیر در مسیرهای انکوژن، مانند سیگنال دهی MYC-mTOR را بیان می کنند (شکل 2i-k).

علاوه بر این، تنظیم‌کننده‌های کروماتین متعدد بین این زیرجمعیت‌ها، از جمله متیل ترانسفراز H3K4me1 SETD7 و هیستون دی‌متیلاز KDM4A، مطابق با تفاوت‌های PTM هیستون مشاهده‌شده توسط CyTOF 47، 48 متفاوت بود (داده‌های توسعه‌یافته شکل 5d). KDM4A، غنی‌شده در سلول‌های K5 hi، H3K9me3 و H3K36me3 را هدف قرار می‌دهد که به طور بالقوه سطوح کاهش یافته و تجمع H3K9me2 آن‌ها را در جمعیت پایه‌مانند نشان می‌دهد. مقایسه با اطلس 50 تک سلولی پستانی نرمال، برنامه‌های حسگر هورمونی را در سلول‌های K5 پایین و یک امضای پیش ساز آلوئولی در سلول‌های K5 hi نشان داد (شکل.

2l)، نتیجه ای مطابق با غنی شدن آنها در تومورهای TN مجرا و پایه 50.