نرم شدن هسته ای گذرا برای فعال سازی ژن زیگوتیک در موش

هسته‌های رویان‌های پستانداران اولیه تحت برنامه‌ریزی مجدد اپی ژنتیکی قرار می‌گیرند که زیگوت را قادر می‌سازد تا به یک ارگانیسم کامل تبدیل شود. در حالی که تغییرات در حالت کروماتین در طول این دوره انتقال بحرانی به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است 1، 2، 3، تغییرات در هسته ای که کروماتین را در خود جای داده است به خوبی شناخته نشده است. در اینجا، با استفاده از روش‌های جذب مستقیم اندامک و دستکاری بیوفیزیکی، متوجه می‌شویم که هسته‌ها در طول مرحله جنینی دو سلولی در موش‌ها به نرمی و انعطاف‌پذیری عمیقی می‌رسند و فعال‌سازی اصلی ژن زیگوتیک را تسهیل می‌کنند.

تغییر شکل برجسته هسته ای به پاکسازی سریع لامین B1 از پوشش هسته ای توسط فاکتور اتوفاژی LC3 نسبت داده می شود. سفت شدن هسته ای توسط احتباس لامین B1 یا بارگذاری بیش از حد آن منجر به فعال شدن ناقص ژن های زیگوتیک و اختلال در رشد می شود. با این حال، جنین هایی که تغییر شکل هسته ای را حفظ می کنند از این تداخل رونویسی فرار می کنند.

میکروسکوپ با وضوح بالا و آنالیزهای هیبریداسیون درجا فلورسانس سه بعدی متوالی تجمع RNA پلیمراز II فعال و موقعیت هماهنگ مکان‌های ژنومی کلیدی در نزدیکی پوشش هسته‌ای قابل تغییر شکل را نشان داد. یک اتصال مولکولی مهندسی شده که هسته‌ها را سفت می‌کند، این فعالیت‌های هسته‌ای را محدود می‌کند و بیان ژن‌های کلیدی فعال‌کننده ژن زیگوتیک را سرکوب می‌کند. با هم، مطالعه ما یک حالت هسته ای فیزیکی مشخص را شناسایی می کند که جنین ها در ابتدای زندگی به دست می آورند و از شروع برنامه رونویسی زیگوتیک پشتیبانی می کند.

ویژگی‌های فیزیکی هسته سلول بسیار متنوع است و شکل و فنوتیپ‌های مکانیکی متمایز را در انواع بافت، حالت‌های فیزیولوژیکی و شرایط بیماری نشان می‌دهد. هسته های شکننده یا بدشکل از علائم سرطان، کاردیومیوپاتی و پیری زودرس هستند 4، 5. هسته های سلول های بنیادی در طی تمایز به تدریج سفت می شوند 4، 5، 6، 7. در حالی که این تغییرات به طور گسترده به عنوان پیامدهای ترکیب هسته ای تغییر یافته و دینامیک کروماتین شناخته می شوند، آنها همچنین بر سازماندهی ژنوم و رونویسی تأثیر می گذارند 8، 9، 10.

با وجود اهمیت، وضعیت فیزیکی هسته در مراحل اولیه رشد پستانداران، زمانی که زندگی آغاز می شود، نامشخص است.

در طول چند شکاف اول، هسته‌ها تحت برنامه‌ریزی مجدد اپی ژنتیکی گسترده قرار می‌گیرند و زیگوت را قادر می‌سازد تا یک برنامه رشد جدید را آغاز کند. در موش‌ها، این انتقال تقریبا در 48 ساعت اول پس از لقاح رخ می‌دهد و با افزایش تولید رونوشت جدید همراه است که به عنوان فعال‌سازی ژن اصلی زیگوتیک (ZGA) 11، 12، 13 شناخته می‌شود. ZGA اصلی در مرحله اواسط تا اواخر دو سلولی رخ می دهد و جنین هایی که ZGA را مختل می کنند در رشد بعدی شکست می خورند.

در حوالی زمان ZGA، کروماتین تغییرات ساختاری و بیوشیمیایی مشخصی همراه با اصلاح‌کننده‌های هیستون و فاکتورهای رونویسی را نشان می‌دهد. در مقابل، مشخص نیست که آیا کروماتین سازمان‌دهنده هسته دچار تغییرات مهمی می‌شود که ZGA را هدایت می‌کند یا خیر. در سلول های سوماتیک، شکل و مکانیک هسته به لایه هایی بستگی دارد که غشای هسته ای داخلی را می پوشانند. لامین ها عمر طولانی دارند و از تخم مرغ غنی شده اند و برای رشد پستانداران حیاتی هستند 18، 19، 20.

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که از دو نوع اصلی، لامین‌های نوع A الگوهای بیانی افتراقی خاص نسل سلولی را نشان می‌دهند، در حالی که لامین‌های نوع B به طور اساسی در طول توسعه بیان می‌شوند. با این حال، پویایی و گذرا بودن آن‌ها، و همچنین مکانیسم تنظیمی هسته اصلی، در مراحل اولیه جنینی به خوبی درک نشده است. به همین ترتیب، چگونه لایه هسته ای، که یک شبکه ساختاری را تشکیل می دهد، مکانیک هسته ای و دینامیک ژنوم را در طول این انتقال بحرانی کنترل می کند، ناشناخته است.

بررسی خصوصیات فیزیکی هسته ای مستلزم کمی سازی مستقیم و دستکاری خواص مکانیکی آنها است. با این حال، دستیابی به این هدف بدون به خطر انداختن بقای سلول، چالشی را به همراه دارد.

برای بررسی خواص فیزیکی هسته‌ای، ما ابتدا اسکن کانفوکال با وضوح بالا تخم‌های بارور شده موش را در طول شکاف‌های اولیه انجام دادیم (شکل 1a). تصاویر سه بعدی (3D) ما از هسته‌های با H2B-mCherry، که بدون توسعه مزاحم بیان شده‌اند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a)، ویژگی‌های شکل متمایز آن‌ها را نشان می‌دهد، که تغییر شکل موضعی ناهموار را در مرحله دو سلولی نشان می‌دهد در مقایسه با ظاهر کروی غالب آنها در مرحله تک سلولی و شکل 1t. 1b).

تصویربرداری Timelapse نشان داد که هسته های یک سلولی در طول چرخه سلولی کروی باقی می مانند (شکل 1d). هسته‌های دو سلولی تحت تغییر شکل تدریجی و آهسته قرار گرفتند، که در حدود 21 ساعت پس از تلقیح (h.p.i.) شروع شد، و در 24-26 h.p.i به اوج خود رسید. و سپس به تدریج با 32-36 h.p.i پسرفت کرد. (شکل 1e). در مرحله چهار سلولی، هسته ها دوباره کروی بودند (شکل 1f) (داده های توسعه یافته شکل 1c,d و فیلم های تکمیلی 1-3). قبل از شروع تغییر شکل، هسته های دو سلولی به طور کامل متورم شده بودند و به اندازه های ثابت رسیده بودند. پس از تغییر شکل، اشکال هسته ای تغییر یافته برای ساعت ها باقی ماندند (داده های توسعه یافته شکل 1e,f).

تغییر شکل مشابهی با استفاده از emerin-eGFP برای پوشش هسته ای (شکل 1g) یا mCherry-NLS برای داخل هسته (داده های توسعه یافته شکل 1g) مشاهده شد.

الف، شماتیک جنین های موش در مراحل اولیه. b، c، تصاویر سه بعدی نمایشی از هسته‌ها که با استفاده از H2B–mCherry (b) و کمی‌سازی کروییت هسته‌ای (c) تجسم شده‌اند. F، زن؛ م، مرد d – f، دوره های زمانی تغییر شکل هسته ای دوبعدی در مراحل تک سلولی (d)، دو سلولی (e) و چهار سلولی (f). تصویربرداری زنده در فواصل 1 ساعت در حدود 52 ساعت برای n = 9 جنین انجام شد. میانگین (نارنجی) و s.d. (منطقه سایه دار) تغییر شکل هسته ای، محاسبه شده همانطور که در قسمت داخلی در d نشان داده شده است، رسم شده است.

g، غشاهای هسته ای با استفاده از emerin-eGFP (سبز) تصویربرداری شدند و برای تغییر شکل هسته ای دوبعدی تجزیه و تحلیل شدند. نوک پیکان مکان های برجسته تغییر شکل را نشان می دهد. h، شماتیک اندازه گیری مکانیکی مبتنی بر نانومورگ. یک جنین با یک پیپت نگهدارنده نگه داشته می شود، در حالی که یک نانومورگ کنترل شده با فشار، هسته را گرفته و کشش می دهد تا کشش و سفتی هسته را اندازه گیری کند. من، عکس‌های فوری از هسته‌های تحت اندازه‌گیری مبتنی بر نانومورگ (قرمز، H2B–mCherry؛ پوشش با میدان روشن). نماینده از چهار آزمایش مستقل (8 و 24 h.p.i.) و دو (48 h.p.i.).

j-l، حداکثر تغییر شکل هسته ای (j)، سفتی هسته (k) و درجه الاستیسیته (l) از آزمایش‌هایی که در i تجزیه و تحلیل شدند. S 0 , S max و S r مانند i هستند . n مقدار نشان دهنده تعداد جنین های تجزیه و تحلیل شده است. برای c، g و j-l، تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون‌های کروسکال-والیس و سپس آزمون مقایسه‌های چندگانه دان انجام شد. میله های افقی ضخیم نشان دهنده مقادیر میانگین (قرمز یا سیاه) هستند. میله های مقیاس، 10 میکرومتر (b، g و i).

این یافته ما را بر آن داشت تا یک ساختار بیوفیزیکی ایجاد کنیم که به طور کمی ویژگی های مکانیکی هسته های اولیه جنینی را در محل مشخص می کند (شکل 1h). این مجموعه مجهز به یک نانو مویرگ کنترل شده با فشار بود که نوک آن در یک جنین بارور شده قرار داده شد تا سطح هسته را بگیرد. فشار مکش ضعیف و ثابت (2.1 × 101 کیلو پاسکال) سطح را تحت فشار قرار داد، که سپس از طریق جابجایی محوری نانومورگ کشیده شد. هسته‌ها را می‌توان به تدریج تحت فشار قرار داد و منجر به کشش شد، و کرنش درست قبل از جدا شدن به حداکثر رسید (شکل 1i).

تجزیه و تحلیل را می توان از مراحل یک سلولی تا چهار سلولی انجام داد، که در آن سیتوپلاسم عمدتا شبیه مایع به حداقل میزان مکانیک اندازه گیری شده را تحت تأثیر قرار داد (داده های توسعه یافته شکل 2a-f). اندازه‌گیری‌ها همچنین به نشانگرهای هسته‌ای حساس نبودند و با نتایج تصویربرداری بدون برچسب قابل مقایسه بودند.

تجزیه و تحلیل ما نشان داد که هسته های دو سلولی به طور قابل توجهی تغییر شکل پذیرتر از هسته های یک سلولی و چهار سلولی هستند (شکل 1j). طبیعت تغییر شکل پذیر در طول چرخه سلولی (از 21 تا 32 h.p.i.) ادامه داشت، حتی زمانی که DNA در حدود 24h.p.i دو برابر شد. سفتی هسته‌ای، همانطور که بر اساس فشار نانومورگ و میزان تغییر شکل هسته‌ای تخمین زده می‌شود، به طور موقت در مرحله دو سلولی کاهش می‌یابد (یک سلولی، 5.0 ± 1.3 nN μm-1؛ دو سلولی، 2.0 ± 0.5 μm-1؛ چهار سلولی، nm-1 ± 1.6 Nm-1. 18، 38 و 13 جنین به ترتیب) (شکل 1k).

مقادیر سفتی بین پیش‌نوکل‌های نر و ماده (30.7 ± 21.3٪، n = 8 جفت) و بین بلاستومرهای هر جنین دو سلولی (23.5 ± 14.5٪، n = 16 جفت) متفاوت بود، در حالی که تفاوت‌ها بین مراحل رشد مشخص شد (شکل 2 پایان). هسته‌های دو سلولی همچنین انعطاف‌پذیری قابل‌توجهی را نشان دادند، برخلاف هسته‌های یک سلولی و چهار سلولی الاستیک‌تر (شکل 1l) (بازیابی شکل، 4.3 ± 91.0٪ برای یک سلول، 66.9 ± 8.0٪ برای دو سلول، و 87.9 ± 4.6٪ برای چهار سلول).

سفتی هسته‌ای دو سلولی قابل تغییر شکل زمانی که جنین‌ها با استفاده از فشار نانومورگ‌های پایین‌تر مورد بررسی قرار گرفتند که رشد را به حداقل رساند (1.2 × 101 kPa؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل 2j,k) سازگار بود. یک رویکرد مبتنی بر مویرگی جایگزین، با استفاده از یک فشار مکش افزایشی که هسته‌ها را تنفس می‌کند، نتایج ثابتی را به همراه داشت (12 جنین در هر مرحله). اینها وضعیت فیزیکی متمایز هسته دو سلولی را تأیید می کنند.

سنجش مبتنی بر نانومورگ ما در 1.2 × 10 1 کیلو پاسکال با حداقل اختلال در رشد، ما را قادر می سازد سفتی هسته دو سلولی را با توانایی رشد جنین مرتبط کنیم (شکل 2a). ما دریافتیم که تمام جنین های بارور شده که به موقع به مرحله بلاستوسیست رسیده اند دارای هسته نرم هستند (2.0 ± 0.6 nN μm-1؛ n = 66 جنین از 66 جنین)، در حالی که تقریبا نیمی از جنین هایی که رشد را مختل کرده اند، هسته های سفت دارند (n = 7 از 15 هسته بیشتر از 15). توسعه طبیعی) (شکل 2b و داده های توسعه یافته شکل 3a).

تشخیص جنین با هسته سفت نادر بود (8.6٪؛ n = 7 از 81 جنین). نتیجه بدون توجه به نوع برچسب فلورسنت و سطوح بیان نشانگر بود (داده های توسعه یافته شکل 3b,c). یک ویژگی مکانیکی مشابه برای جنین های شبیه سازی شده ایجاد شده از طریق انتقال هسته ای سلول های سوماتیک مشاهده شد (شکل 2a,b و داده های توسعه یافته شکل 3a,d,e) (n = 46 جنین). بنابراین، هسته های دو سلولی قابل تغییر شکل نشانه ای از توسعه طبیعی قبل از لانه گزینی هستند.

الف، شماتیک سنجش. جنین‌های تهیه‌شده از طریق لقاح آزمایشگاهی یا از طریق انتقال هسته‌ای سلول‌های سوماتیک، در مرحله دو سلولی با استفاده از فشاری که رشد را به حداقل رساند (1.2×101kPa؛ داده‌های گسترده شکل 2j,k)، تحت اندازه‌گیری مکانیکی مبتنی بر نانومورگ قرار گرفتند و پس از آن، رویان‌ها کشت استاندارد را از سر گرفتند. ب، رابطه بین سفتی هسته دو سلولی و فراوانی توسعه تا مرحله بلاستوسیست در 96 h.p.i. n مقدار نشان دهنده تعداد جنین های تجزیه و تحلیل شده است.

برای b، تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون U Mann-Whitney (دو طرفه) انجام شد. میله های افقی ضخیم (قرمز) مقادیر میانگین را نشان می دهند.

ما در مرحله بعد مکانیسم مولکولی زیربنای وضعیت فیزیکی متمایز هسته دو سلولی را بررسی کردیم. با استفاده از ایمونوفلورسانس، ما ابتدا چهار لامین اصلی، A/C، B1 و B2 را مورد بررسی قرار دادیم و دریافتیم که لامین B1 به طور موقت از پوشش هسته ای دو سلولی پاک می شود، تقریبا به موازات نرم شدن هسته ای (شکل 3a,b). پاکسازی سریع و قابل توجه بود، با کاهش تقریبا 70 درصدی در سیگنال محیطی در طول مرحله دو سلولی اولیه تا اواسط (21 تا 24 h.p.i.؛ شکل 3b).

سطوح Lamin A/C و B2 نیز تغییر کردند، اما روند آنها تدریجی و یکنواخت بود، با کاهش جزئی، در صورت وجود، در طول مرحله دو سلولی (شکل 3a و داده های توسعه یافته شکل 4a). پروتئین پوشش هسته ای دیگر، Lap2β، نیز کمی تغییر کرد (داده های توسعه یافته شکل 4b). تصویربرداری از جنین زنده پاکسازی لامین B1 را از پوشش هسته ای دو سلولی با ثابت زمانی 44 ± 86 دقیقه تایید کرد (n = 5 جنین؛ شکل 3c و داده های توسعه یافته شکل 4c). یک سنجش ایمونوبلات کاهش لامین B1 را در طول مرحله دو سلولی نشان داد (شکل 3d)، که نشان دهنده تخریب است.

a، تصاویر ایمونوفلورسانس از لامین های درون زا در جنین های اولیه (h.p.i مانند شکل 1j-l هستند). تصاویر نماینده از شش آزمایش مستقل نشان داده شده است. شرایط تصویربرداری یکسان استفاده شد. ب , کمیت لامین B1 در پوشش هسته از سنجش در a . ج، داده‌های تصویربرداری زنده که سیگنال‌های mEGFP-lamin B1 را در پوشش هسته‌ای دو سلولی نشان می‌دهد، که تحت شرایطی به دست آمده است که نور سفید و سمیت نوری را به حداقل می‌رساند. d، ایمونوبلات لیزات از جنین های دو سلولی برای لامین B1. β-اکتین به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد. دو آزمایش مستقل با نتایج مشابه.

e , نمودارهای سازه های لامین B1 مورد استفاده در این مطالعه. کنه های قرمز نشان دهنده مکان های جهش یافته هستند. aa، اسید آمینه؛ LIR، منطقه تعامل LC3. f، لامین‌های درون‌زا در جنین‌ها (24 h.p.i.) که sfLB1 یا sfLB1Δ را بیان می‌کنند، با استفاده از ایمونوفلورسانس تجسم می‌شوند. تصاویر نماینده از سه تا پنج آزمایش مستقل نشان داده شده است. g، کمیت لامین ها در پاکت هسته ای از سنجش در f، که در b تجزیه و تحلیل شده است. h، نرخ رشد جنین های بیان کننده sfLB1 یا sfLB1Δ در مقابل کنترل غیر تزریقی.

من، تجزیه و تحلیل تصویربرداری زنده برای تعیین کمیت سیگنال‌های WT ذوب شده با mCherry و لامین B1 جهش یافته در پوشش هسته‌ای دو سلولی انجام شد. j، کولوکالیزاسیون لامین B1 (قرمز) با لیزوزوم ها (سبز) در 24 h.p.i. هسته ها خارج از صفحه تصویر بودند. k , l , تعداد کل کانون های B1 لامین ( k ) و لیزوزوم ها ( l ) از سنجش ها در j . متر، مدلی که پاکسازی لامین B1 با واسطه LC3 را در مرحله جنینی دو سلولی نشان می دهد. n مقدار نشان دهنده تعداد جنین های تجزیه و تحلیل شده است.

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون کروسکال-والیس و سپس آزمون مقایسه چندگانه دان (b، g، k و l) و آزمون χ2 (h) انجام شد. میله های افقی ضخیم (قرمز) نشان دهنده میانگین (b، g، k و l) هستند. برای c و i داده ها میانگین ± s.e.m هستند. میله های مقیاس، 10 میکرومتر (a، f و j). داده های سورس blot در شکل تکمیلی 1 ارائه شده است. داده های تصویر اضافی در شکل های داده های توسعه یافته ارائه شده است. 4c و 5a.

آزمایش آزمایشی ما با استفاده از ورتمانین نشان داد که اتوفاژی باعث افزایش پاکسازی لامین B1 می‌شود (داده‌های توسعه یافته شکل 4d). اتوفاژی در جنین های اولیه فعال است و برای رشد قبل از لانه گزینی ضروری است 21 . در تصویربرداری از جنین زنده، فاکتور اتوفاژی LC3 22 در مرحله تک سلولی منتشر شد و در هسته دو سلولی انباشته شد (داده های توسعه یافته شکل 4e). ریز تزریق آنتی بادی ما که LC3 را هدف قرار می دهد، پاکسازی لامین B1 را سرکوب کرد (داده های توسعه یافته شکل 4f). پیشرفت چرخه سلولی همانطور که توسط EdU نظارت می شود طبیعی بود (داده های توسعه یافته شکل 4g).

بنابراین ما ساختاری را طراحی کردیم که با برهمکنش درون زا بین لامین B1 و LC3 تداخل می کند، با استفاده از یک قطعه کوتاه از لامین B1 حامل حوزه های اتصال LC3 و یک سیگنال محلی سازی هسته ای ذاتی 23 (از این پس، sfLB1؛ شکل 3e). هنگامی که در جنین بیان می شود، این قطعه عمدتا نوکلئوپلاسمی بود (داده های توسعه یافته شکل 4h)، در حالی که یک سوبسترای اصلی اتوفاژی p62 سطوح پروتئین را ثابت نگه داشت (داده های توسعه یافته شکل 4i). تجزیه و تحلیل ما نشان داد که پاکسازی لامین B1 توسط sfLB1 سرکوب شد، در حالی که لامین A/C و B2 تا حد زیادی بدون اختلال باقی ماندند (شکل 3f,g).

تجمع لامین B1 در آنالیز وسترن بلات لیزات قابل تشخیص بود (داده های توسعه یافته شکل 4j). یک نوع sfLB1 (sfLB1Δ)، که نوکلئوپلاسمی بود اما با اتصال LC3 منسوخ شده 23 (داده های توسعه یافته شکل 4h,k)، تأثیر کمی بر پاکسازی لامین B1 داشت (شکل 3f،g). رشد جنین توسط sfLB1 مختل شد، اما نه توسط sfLB1Δ (شکل 3h).

برای درک مبنای مکانیکی پاکسازی لامین B1، ما گزارشگرهای فلورسنت را بر اساس لامین B1 تمام قد که با mCherry ذوب شده است، ساختیم. مطابق با نتایج نشان‌داده‌شده در شکل 3a-c، ساختار نوع وحشی (WT) (flLB1wt؛ شکل 3e) در پوشش هسته‌ای موضعی شده و خلاصی سریع لامین B1 را نشان می‌دهد (T 1/2 = 83 ± 44 دقیقه، n = 18 داده‌ها و شکل 5. پایان).

سه سازه دیگر جهش‌هایی را در نزدیکی یا در یک موتیف هسته منطقه تعامل LC3 (flLB1(5A) و flLB1 (F454A/L457A)) یا در محل اصلی فسفوریلاسیون CDK1 ترمینال N برای تجزیه پوشش هسته‌ای 24 (flLB1) (S4) انجام دادند. این سازه ها همچنین در پوشش هسته ای دو سلولی محلی شده اند (داده های توسعه یافته شکل 5a). قابل توجه، جهش هایی که برهمکنش های LC3 را لغو کردند (داده های توسعه یافته شکل 5b) پاکسازی لایه B1 را سرکوب کردند، در حالی که جهش در محل CDK1 از پاکسازی جلوگیری نکرد (شکل 3i).

جهش‌ها در flLB1(5A) در محل مورد هدف تخریب اتوفاژیک لامین B1 در طول پیری سلولی ناشی از انکوژن بودند. گزینش پذیری لامین B1 نسبت به لامین A/C و B2 نیز با پدیده گزارش شده در سلول های پیر مطابقت داشت 23 .

روش ما بیشتر نشان داد که لامین B1 از طریق یک مسیر اتوفاژی - لیزوزوم تخریب می شود. این با ردیابی سرنوشت flLB1wt و شناسایی محلی سازی لیزوزومی غالب آن و تشکیل کانون ها تأیید شد (n = 18 جنین؛ شکل 3j,k). flLB1 (5A) و flLB1 (F454A/L457A) بسیار کمتر در لیزوزوم ها موضعی داشتند (n = 12 و 14 جنین؛ شکل 3j,k)، در حالی که تعداد لیزوزوم ها قابل مقایسه بود (شکل 3l).

ما ساختارهای برجسته لامین-B1 مثبت برآمده از غشای هسته ای بیرونی 23 و یا تجمع لیزوزوم ها در سطح هسته 25 را در محدوده زمانی مورد بررسی مشاهده نکردیم. در مجموع، نمای مکانیکی ما از ترخیص لامین B1 در شکل 3m نشان داده شده است.

ما در مرحله بعد اثر لامین B1 را بر سفتی هسته دو سلولی بررسی کردیم. نانومورگ‌ها نشان دادند که هسته‌های دو سلولی که پوشش آن با لامین B1 درون‌زا غنی شده بود، سفت‌تر و پلاستیک کمتری نسبت به گروه‌های کنترل داشتند (4.2 ± 1.3 nN μm-1، n = 17 جنین) (sfLB1؛ شکل 4a-d). این هسته ها به اندازه هسته های یک سلولی و چهار سلولی معمولی سفت بودند (~5 nN میکرومتر -1، شکل 1k). بعدا لامین B1 را بیش از حد بیان کردیم. از آنجایی که WT lamin B1 به سرعت از پوشش هسته‌ای جدا شد، از flLB1 (5A) و flLB1 (F454A/L457A) برای جبران فاصله استفاده کردیم.

در حالی که بارگذاری بیش از حد این لایه‌ها منجر به فروپاشی هسته‌ها می‌شود، سطوح بیان تیتراسیون شکل کلی هسته را حفظ می‌کند، با لامین B1 در پوشش هسته‌ای در سطحی قابل مقایسه با sfLB1 بارگذاری می‌شود (شکل 4a,b). ما دریافتیم که flLB1 (F454A/L457A) کشش و سفتی هسته را عمیقا افزایش داد (4.0 ± 1.1 nN μm-1، n = 17 جنین) (شکل 4c,d)، در حالی که فعالیت کلی اتوفاژیک همانطور که توسط سیگنال LC3 ارزیابی شد (E.c5end داده ها) حفظ شد. فنوتیپ به طور کمی رویان‌هایی را که از طریق sfLB1 آشفته شده بودند منعکس می‌کرد.

در مقابل، flLB1(F454A/L457A)ΔC، که فاقد موتیف کربوکسی-ترمینال CaaX برای فارنسیلاسیون 16 بود و نوکلئوپلاسمی باقی ماند، به طور قابل توجهی شکل و مکانیک هسته را تغییر نداد (داده های توسعه یافته شکل 5d). این داده ها نشان می دهد که سفتی هسته ای دو سلولی بستگی به محلی سازی پاکت هسته ای لامین B1 دارد.