یک دوگانگی تنظیم شده از نظر محیطی در دودمان سلولی ریشه

رشد گیاه بسیار پلاستیکی است، با رشد و معماری به طور مداوم توسط شرایط محیطی شکل می گیرد. به عنوان مثال، ریشه ها رشد خود را با شرایط آب، مواد مغذی و خاک محلی تنظیم می کنند. علی‌رغم این انعطاف‌پذیری، انواع سلول‌های ریشه منفرد عموما به‌عنوان جمعیت‌های تا حد زیادی همگن در نظر گرفته می‌شوند که در امتداد یک مسیر رشد واحد پیشرفت می‌کنند.

در اینجا نشان می‌دهیم که به جای پیشرفت در یک مسیر تکوینی، اکثر مسیرهای دودمان سلولی ریشه آرابیدوپسیس یک توپولوژی دوگانه کلیشه‌ای را نشان می‌دهند، همانطور که توسط توالی‌یابی RNA تک سلولی و نقشه‌برداری رونوشت فضایی نشان داده شد. یک شاخه با یک برنامه رونویسی مشخص می شود که در انواع سلول های متعدد به اشتراک گذاشته می شود و برای ژن های مرتبط با پاسخ های محیطی، از جمله سیگنال دهی اسید آبسیزیک (ABA) غنی می شود.

این حالت به صورت تکرارپذیر در زیرمجموعه‌ای از سلول‌ها در چندین نوع سلول، مستقل از دودمان رشدی رخ می‌دهد، در نتیجه لایه دیگری از هویت سلولی ریشه را آشکار می‌کند. این در سراسر اکوتیپ‌های آرابیدوپسیس حفظ می‌شود و علی‌رغم اختلالات عمده در هویت رشدی همچنان ادامه دارد. علاوه بر این، در جهش‌یافته‌های فاقد ABA و حساس به ABA کاهش می‌یابد و در شرایط کمبود آب شیوع بیشتری پیدا می‌کند. این یافته‌ها با هم، لایه دیگری از هویت سلول ریشه را نشان می‌دهند که بر دودمان رشدی قرار گرفته و شیوع آن توسط شرایط محیطی تعدیل می‌شود.

این نتایج یک منبع ناشناخته قبلی از ناهمگونی رونویسی مرتبط با محیط را که در انواع سلول های ریشه به اشتراک گذاشته شده است، آشکار می کند.

ریشه Arabidopsis thaliana یک مدل ارزشمند برای مطالعه تمایز سلولی در گیاهان است. انواع سلول ها در لایه های متحدالمرکز در اطراف یک بسته عروقی مرکزی قرار گرفته اند و از جمعیت سلول های بنیادی متمایز که در نزدیکی نوک ریشه در مریستم نگهداری می شوند، بوجود می آیند. همانطور که سلول های بنیادی تقسیم می شوند، فرزندان آن ها به سمت ساقه جابجا می شوند و به تدریج تمایز می یابند، که مسیرهای رشدی را ایجاد می کند که در آن آرایش فضایی سلول ها، پویایی زمانی تمایز را خلاصه می کند (شکل 1a).

a، نمایش شماتیک نوک ریشه. b، نمودار UMAP اطلس مرجع ما از 87056 سلول Arabidopsis Col-0 (9 نمونه). سلول‌ها توسط خوشه‌هایی رنگ‌آمیزی می‌شوند که هویت آن‌ها توسط HCR کل کوه تعیین شد. ج، نمودارهای جعبه ای بیانگر 15 نشانگر مخصوص خوشه را نشان می دهد که برای تعیین هویت خوشه از طریق HCR تمام کوه استفاده می شود (87056 سلول از 9 آزمایش مستقل). جعبه‌ها میانه، صدک‌های 25 تا 75 و سبیل‌هایی را نشان می‌دهند که تا شدیدترین مقادیر در 1.5× محدوده بین‌چارکی گسترش می‌یابند. نقاط سفید نشان دهنده معنی است.

d، بالا، تمام کوه HCR از 15 نشانگر شناسایی شده در c برای انتساب دقیق نوع سلولی خوشه ها. پایین، نمای نزدیک نشانگرهای استیل برای وضوح نشان داده شده است. تصاویر نماینده نشان داده شده است. نتایج حداقل در دو آزمایش مستقل با نتایج مشابه بازتولید شد. میله های مقیاس، 50 میکرومتر. e، نمودار UMAP اطلس مرجع نشان می دهد که تقسیمات مختلف دودمان سلولی به طور مستقل در تجزیه و تحلیل شبه زمان درمان شده اند. سلول ها در هر دودمان توسط گروه های فرعی رنگ می شوند. f، نمودار UMAP که تخصیص شبه زمان انتشار را برای هر سلول، در هر دودمان نشان می دهد.

t = 0 مربوط به سلول با بالاترین امتیاز مریستمی و t = 1 نشان دهنده متمایزترین حالت از t = 0 در اصل و نسب است. g، مسیرهای تکاملی به دست آمده از ترکیب اتصال بین زیرخوشه‌های نشان‌داده‌شده در e محاسبه‌شده در یک PAGA و استنتاج شبه زمان محاسبه‌شده در f، دو شاخه رشدی متمایز را نشان می‌دهند که بر همه دودمان سلولی تأثیر می‌گذارند (به نام‌های شاخه 1 و شاخه 2).

توالی یابی RNA تک سلولی (scRNA-seq) امضاهای رونویسی انواع سلول های ریشه آرابیدوپسیس را اصلاح کرده و بازسازی با وضوح بالا این مسیرهای تکاملی 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 را فعال کرده است. اگرچه این مطالعات حالت‌های سلولی گذرا را در دودمان‌های منفرد شناسایی کرده‌اند، آن‌ها تا حد زیادی هر دودمان را به‌طور مستقل مورد تجزیه و تحلیل قرار داده‌اند، که ممکن است حالت‌های رونویسی مشترک در انواع سلول‌های مختلف را صرف نظر از هویت رشدی نادیده بگیرد.

اینکه آیا چنین حالت‌های رونویسی مشترک وجود دارند و چگونه به هویت سلول ریشه کمک می‌کنند تا حد زیادی ناشناخته باقی می‌مانند.

برای توصیف حالات سلولی در طول رشد ریشه، در اینجا ما یک اطلس scRNA-seq (10x Genomics) با وضوح بالا از نوک ریشه A. thaliana Col-0 تولید کردیم (شکل 1b). پس از فیلتر کردن سلول‌های با کیفیت پایین، دوتایی‌ها و ژن‌هایی که به طور قابل‌توجهی تحت‌تاثیر جداسازی پروتوپلاست قرار گرفتند، ادغام دسته‌ای یک اطلس مرجع متشکل از 87056 سلول از 9 تکرار، با مجموع 25784 ژن شناسایی‌شده ایجاد کرد (شکل 1b، جداول تکمیلی 1 و 2 و شکل تکمیلی).

ما 27 خوشه رونویسی متمایز را شناسایی کردیم و هویت آنها را با ترکیب بیان دیفرانسیل با واکنش زنجیره ای هیبریداسیون کل کوه (HCR) 10 و پاکسازی بافت 11 برای ترسیم فضایی بیان 15 ژن نشانگر خاص اختصاص دادیم (شکل 1b-d). این فرآیند تمام انواع سلول های شناخته شده، از جمله زیرجمعیت های کلاهک ریشه متمایز (زود، نوک و جانبی) را حل کرد (شکل 1b-d). یک خوشه واقع بین کلاهک ریشه و اپیدرم را نمی توان مستقیما با بیان نشانگر اختصاص داد.

با این حال، بر اساس موقعیت و منشاء رشدی این بافت‌ها، به عنوان "اپیدرم-مریستم" مشروح شد (شکل 1b).

سلول ها بر اساس دودمان رشدی خود (اپیدرم، کلاهک ریشه، قشر، اندودرم، دور چرخه قطب آوند چوبی (XPP)، دور چرخه قطب آبکش (PPP)، پروکامبیوم، آبکش و آوند چوبی) گروه بندی شدند، که تایید کرد که برنامه های انتوژنیک عامل تعیین کننده اصلی هویت سلول ریشه باقی می مانند (شکل). سلول های هر دودمان به طور مستقل برای بازسازی مسیرهای تکاملی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

یک امتیاز مریستمی، مشتق شده از ژن های غنی شده در خوشه اپیدرم مریستمی، برای هر دودمان محاسبه شد، و سلول با بالاترین امتیاز به عنوان نقطه شروع مسیر (0 = t) تعریف شد. توپولوژی مسیر با استفاده از انتزاع نمودار مبتنی بر پارتیشن (PAGA) استنباط شد، و پیشرفت تکاملی توسط شبه زمان انتشار از t = 0 (شکل 1e-g) مرتب شد.

دودمان کلاهک ریشه پیچیده ترین توپولوژی را نشان داد و رویدادهای رشدی شناخته شده را خلاصه کرد. یعنی تقسیم جمعیت‌های جانبی و نوک و هم‌گرایی آنها با سلول‌های کلوملا برای تشکیل سلول‌های مرز مانند 12 (شکل 1g). این مسیرها توسط ژن‌های نشانگر مخصوص مرحله 13، 14، 15 پشتیبانی می‌شوند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a)، که بیشتر مسیرهای تکاملی استنباط‌شده را تأیید می‌کند.

اگرچه پیش‌بینی می‌شود که برخی دودمان‌ها از زیرگروه‌های سلولی متمایز، مانند آبکش و آوند چوبی که به ترتیب از متافلوئم و پروتوفلوم و متاکسیلم و پروتوکسیلم ساخته شده‌اند و اپیدرم که به موهای ریشه و موهای غیر ریشه تقسیم می‌شوند، تشکیل شده‌اند، انتظار می‌رود که هر کدام از یک حالت متمایز به رشد متفاوتی را دنبال کنند. قابل‌توجه، PAGA نشان داد که همه انواع سلول‌ها و انواع فرعی دو شاخه (شاخه 1 و شاخه 2) را نشان می‌دهند که در نقطه شبه‌زمان اولیه از هم جدا می‌شوند (شکل 1g).

فقط اپیدرم حاوی سلول های قبل از این دوشاخه و یک جمعیت مریستمی به وضوح قابل شناسایی است. در اکثر دودمان‌های دیگر، انشعاب مستقیما از t = 0 رخ می‌دهد، که احتمالا نشان‌دهنده مشکل در گرفتن سلول‌های مریستمی لایه داخلی نادرتر در طول پروتوپلاست است.

برای اعتبارسنجی مستقل توپولوژی استنباط‌شده، از HCR تمام کوه برای شناسایی نشانگرهای اولیه و دیررس در اپیدرم، اندودرم و XPP استفاده شد (داده‌های توسعه یافته شکل 1b-e). در هر سه اصل و نسب، ژن‌هایی که پیش‌بینی می‌شد در نزدیکی t = 0 بیان شوند، نزدیک‌تر به مریستم از نشانگرهای پیش‌بینی‌شده دیر شناسایی شدند. مطابق با این یافته، نشانه‌های ژن مریستم، ازدیاد طول و بلوغ به‌دست‌آمده از مطالعه قبلی 8، طبق انتظارات در طول شبه‌زمان پیشرفت کردند.

این نتیجه از استحکام تخصیص t = 0 و ترتیب توسعه استنباط شده ما پشتیبانی می کند (داده های توسعه یافته شکل 2a).

استنتاج مسیر مستقل با استفاده از Monocle نیز توپولوژی دوفید را بازیابی کرد (داده های توسعه یافته شکل 2b-d). ترتیب سلولی در هر دو شاخه با شبه زمان انتشار بسیار مرتبط بود و توسط تجزیه و تحلیل سرعت RNA پشتیبانی می شد (داده های توسعه یافته شکل 2e-g).

این داده‌ها با هم نشان می‌دهند که علاوه بر پیشرفت تکاملی، سلول‌ها در اکثر انواع سلول‌ها دو حالت رونویسی جایگزین را نشان می‌دهند. بنابراین این نتیجه وجود یک سطح پیچیدگی اضافی را که قبلا شناسایی نشده بود در هویت سلول نشان می دهد.

برای شناسایی برنامه‌های رونویسی مرتبط با نوع سلول، پیشرفت رشد و هویت شاخه، تجزیه و تحلیل شبکه هم‌بیان ژن با ابعاد بالا (hdWGCNA) را انجام دادیم. از 6649 ژن اختصاص داده شده به 25 ماژول هم بیانی شناسایی شده (شکل 2a،b و جدول تکمیلی 3)، اکثر آنها در انواع سلولی خاص، گروه هایی از انواع سلولی یا مراحل رشد غنی شده بودند. در مقابل، ماژول های 20 و 21 به طور خاص در شاخه 1 در تمام دودمان ها غنی شدند.

این نتیجه نشان می‌دهد که یک برنامه رونویسی مستقل از هویت رشدی بین انواع سلول‌های متعدد به اشتراک گذاشته شده است.

یک نمودار UMAP از اطلس مرجع ما که هویت های سلولی مختلف به دست آمده با استفاده از تجزیه و تحلیل مسیر را نشان می دهد. b، نمودارهای UMAP که الگوی بیان (امتیاز ماژول، Seurat) 25 ماژول ژنی بیان شده مشترک (M1-M25) به دست آمده از تجزیه و تحلیل hdWGCNA را نشان می دهد. ماژول ها بر اساس الگوی بیان گروه بندی می شوند و ماژول های ویژه شاخه 1 (M20 و M21) با یک مستطیل صورتی برجسته می شوند. ج، تعداد ژن ها در هر مدول هم بیانی (در مجموع 6649 ژن). ماژول های مخصوص شعبه 1 با رنگ صورتی برجسته شده اند.

d، UMAP نمودارهایی را نشان می دهد که تعداد ژن ها و تعداد UMI در هر سلول را در اطلس مرجع ما نشان می دهد.

در تمام انواع سلول ها، سلول های شاخه 1 به طور مداوم حاوی ژن های شناسایی شده بیشتر و تعداد شناسه مولکولی منحصر به فرد (UMI) بالاتر از سلول های شاخه 2 (شکل 2c) بودند که نشان دهنده فعالیت رونویسی کلی بیشتر بود. ماژول‌های 20 و 21 نیز از جمله بزرگ‌ترین ماژول‌های هم‌بیان شناسایی‌شده بودند (به ترتیب 320 و 615 ژن؛ شکل 2d)، که نشان داد این عدم تقارن رونویسی شامل یک برنامه بیان ژنی هماهنگ است.

اگرچه تجزیه و تحلیل PAGA دو شاخه را در سلول‌های غیرمویی حل نکرد، غنی‌سازی ماژول‌های شاخه خاص و افزایش فراوانی رونوشت نشان می‌دهد که هر دو جمعیت نیز در این دودمان وجود دارند.

با توجه به تفاوت‌های رونویسی غیرمنتظره بین دو شاخه از یک نوع سلول، در مرحله بعدی به دنبال حذف مصنوعات تجربی یا تحلیلی احتمالی بودیم که ممکن است دوشاخه‌های مسیری جعلی ایجاد کرده باشند. جداسازی شاخه‌ها توسط فاز چرخه سلولی، دسته‌های تجربی یا ژن‌های تحت‌تاثیر جداسازی پروتوپلاست توضیح داده نشد (داده‌های توسعه یافته شکل 3a-e). از آنجایی که ریشه‌هایی که روی سطح آگار رشد می‌کنند، ریزمحیط‌های متمایز رو به آگار و رو به هوا را تجربه می‌کنند، ما همچنین نوک ریشه‌های گیاهانی را که به طور کامل در آگار رشد کرده‌اند، نمایه کردیم.

مسیرهای bifid به وضوح در همه انواع سلول قابل تشخیص باقی ماندند، که بنابراین این ریزمحیط های رشد را به عنوان یک عامل کمک کننده رد کرد (داده های توسعه یافته شکل 3f-h).

احتمال دیگر این بود که شاخه پایینی UMI (شاخه 2) سلول‌های آسیب‌دیده‌ای را منعکس می‌کرد که رونوشت‌های کمتری از آنها گرفته شد، علی‌رغم اینکه این سلول‌ها محتوای رونوشت میتوکندری یا کلروپلاستیک بالا را نشان نمی‌دادند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3i-j). اگر چنین باشد، ژن‌های با بیان پایین ترجیحا در شاخه 1 UMI بالاتر شناسایی می‌شوند، در حالی که ژن‌های با بیان بالا بین هر دو شاخه مشترک خواهند بود. با استفاده از XPP، ما دریافتیم که کاهش ژن‌های اختصاصی شاخه 1 در شاخه 2 به طور قابل‌توجهی بیش از میزان مورد انتظار از سطح بیان به تنهایی است (داده‌های توسعه یافته شکل 4a-c).

به همین ترتیب، جداسازی شاخه پس از نمونه برداری تصادفی سلول های شاخه 1 برای مطابقت با توزیع UMI همتایان شاخه 2 آنها و پردازش مجدد مجموعه داده در سه تکرار مستقل ادامه یافت (داده های توسعه یافته شکل 4d-g). با هم، این تجزیه و تحلیل نشان می دهد که عدم فعال سازی برنامه رونویسی شاخه 1 در سلول های شاخه 2 را نمی توان صرفا با فراوانی رونوشت پایین آنها توضیح داد.

در نهایت، هر دو شاخه و ماژول‌های ویژه شاخه 1 نیز در مجموعه داده 16 توالی‌یابی RNA نوک ریشه ریشه آرابیدوپسیس (snRNA-seq) که قبلا منتشر شده بود شناسایی شدند (داده‌های توسعه یافته شکل 5). این نتیجه تفاوت های فنی بین سلول ها و هسته ها، جداسازی پروتوپلاست یا آسیب سلولی را به عنوان توضیحی برای انشعاب مشاهده شده رد می کند.

برای نشان دادن بیشتر استحکام شاخه‌های مشاهده‌شده، ما دو مجموعه داده‌های scRNA-seq 7 و 8 مستقل که قبلا منتشر شده بود، را مجددا تحلیل کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل‌های 6 و 7). در هر سه مورد (یک مجموعه داده snRNA-seq و دو مجموعه داده scRNA-seq)، هر دو شاخه را در همه انواع سلول، همراه با UMI و محتوای ژن بالاتر سلول‌های شاخه 1 و غنی‌سازی ماژول‌های 20 و 21 بازیابی کردیم.

اولین مطالعه scRNA-seq 7 در ابتدا شاخه ها را شناسایی نکرد زیرا بسیاری از سلول های شاخه 2 به دلیل محتوای UMI پایین آنها حذف شدند. برعکس، مطالعه دوم 8، که دو مجموعه داده scRNA-seq ریشه منتشر شده را ادغام می‌کند، به وضوح دو شاخه را در نمودارهای تقریب و طرح ریزی چندگانه یکنواخت (UMAP) نشان داد و به حضور آنها در اپیدرم، قشر و اندودرم اشاره کرد. با این حال، این یافته ها بیشتر مورد بررسی قرار نگرفتند.

برخی از کتابخانه‌های ما از ترکیبی هم‌مولاری از سلول‌های Col-0 و یک اکوتیپ دوم تولید شده‌اند، که تعیین تجربی نرخ‌های چندگانه سلولی را امکان‌پذیر می‌سازد و همزمان اطلس‌های نوک ریشه را برای چهار اکوتیپ دیگر Arabidopsis تولید می‌کند (C24، Cvi-0، Ler و Ws-2؛ Methods: Methods, Fig.2ppt). هر دو شاخه در تمام دودمان های سلولی در همه اکوتیپ ها، با واحدهای بیان مشترک غنی شده در شاخه 1 شناسایی شدند (داده های توسعه یافته شکل 8b,c).

علاوه بر این، کمتر از 4 درصد از ژن‌های ماژول ویژه شاخه 1 به طور متفاوت در هر اکوتیپ بیان می‌شوند، که نشان می‌دهد برنامه رونویسی زیربنای انشعاب بسیار حفظ شده است (داده‌های توسعه یافته شکل 8e,f). در میان اکوتیپ‌های مورد تجزیه و تحلیل، فقط Cvi-0 نسبت سلول‌های شاخه 1 (نسبت به شاخه 2) را در مقایسه با Col-0 به طور قابل‌توجهی کمتر نشان داد و اکوتیپ با بیشترین واگرایی رونویسی کلی بود (داده‌های توسعه یافته شکل 8d-f).

یک مطالعه قبلی snRNA-seq 16 همچنین یک اطلس snATAC-seq از نوک ریشه ایجاد کرد. با استفاده از این داده‌های دسترسی کروماتین به تنهایی، سلول‌های مربوط به هر شاخه را شناسایی کردیم، با سلول‌های شاخه 1 که بخش‌های بالاتری از خواندن را در پیک نشان می‌دهند و افزایش غنی‌سازی سایت شروع رونویسی، مطابق با فعالیت رونویسی بیشتر (داده‌های توسعه‌یافته شکل 9a-c). قابل‌توجه، این افزایش مختص ژن‌های متعلق به ماژول‌های ویژه شاخه ۱ بود.

از طریق این روش متعامد، این یافته عدم تقارن رونویسی زیربنای دوگانگی شناسایی شده توسط مسیرهای scRNA-seq را تأیید می کند (داده های توسعه یافته شکل 9d,e).

برای تأیید مستقل این حالت رونویسی در داخل بدن، رونوشت‌های پنج ژن اختصاصی شاخه 1 را با HCR تمام کوه در نوک ریشه‌های دست نخورده اندازه‌گیری کردیم: AT2G41660 (همچنین به عنوان MIZ1 شناخته می‌شود)، AT3G04010، AT4G26080 (همچنین به‌عنوان ABIAT05GS شناخته می‌شود) ) و AT4G24060 (همچنین به عنوان VDOF1 شناخته می شود) (شکل 3a و داده های توسعه یافته شکل 10a,b). هر پنج ژن بیان ناهمگنی را در انواع سلولی که در آن بیان می‌شوند نشان دادند، با برخی از سلول‌ها غنی‌سازی رونوشت قوی (مثبت) و برخی دیگر کاهش (منفی) را نشان دادند.

اندازه‌گیری فلورسانس حجمی سلول‌های اپیدرمی، قشر و اندودرم تقسیم‌بندی شده، تفاوت‌های 20 برابری را در شدت فلورسانس بین سلول‌ها در همان لایه بافت تایید کرد (شکل 3a). نشانگرهای نوع سلول متعارف در سلول‌های منفی قابل تشخیص باقی ماندند، که نشان می‌دهد کاهش یافتن نشانگر شاخه 1 بعید است منعکس‌کننده شکست عمومی تشخیص HCR باشد (داده‌های توسعه یافته شکل 10c).

اگرچه شاخه 2 فاقد برنامه رونویسی متمایز است، تجزیه و تحلیل بیان ژن اپیدرمی AT3G01720 را تا حد زیادی مکمل نشانگر شاخه 1 AT5G56550 شناسایی کرد، الگویی که توسط HCR in vivo تایید شده است (شکل 3b-h). کمی سازی فلورسانس حجمی سلول های تقسیم شده در سه ریشه مستقل، همراه با مدل سازی مخلوط گاوسی از هر دو امتیاز scRNA-seq و نسبت فلورسانس HCR، دو جمعیت اپیدرمی مجزا مربوط به سلول های شاخه 1 و شاخه 2 را شناسایی کرد.

این نتیجه شواهد مستقیم in vivo برای دو جمعیت سلولی متمایز رونویسی در یک لایه بافت فراهم می کند (شکل 3e-h).

a، نمودارهای UMAP (بالا) و بخش‌های نوری (پایین) که تشخیص رونوشت چهار نشانگر شاخه 1، AT2G41660، AT3G04010، AT4G26080 و AT5G56550 را نشان می‌دهند، هر دو در سیلیکون از داده‌های scRNA-seq و in vivo توسط کل داده‌های scRNA-seq-mount. خطوط زرد نشان دهنده موقعیت نسبی مقطع طولی و عرضی است. سلول های نماینده مثبت (+) یا منفی (-) برای هر رونوشت در اپیدرم (ep.)، قشر (co.) و اندودرم (en.) نشان داده شده است.

تصاویر بخش‌بندی‌شده مرتبط در سمت راست، همان بخش‌های نوری را پس از تقسیم‌بندی سه‌بعدی اپیدرم، قشر و اندودرم، با سلول‌هایی که با میانگین شدت فلورسانس رنگ‌شده‌اند، نشان می‌دهند. b-e، یک ژن اختصاصی شاخه 2 (AT3G01720)، که متقابلا منحصر به نشانگر شاخه 1 AT5G56550 است، در اپیدرم شناسایی شد. UMAPهایی که الگوی بیان AT3G01720 (b)، AT5G56550 (c) و تفاوت امتیاز بیان بین AT3G01720 و AT5G56550 را در اپیدرم نشان می‌دهند (d).

توزیع امتیاز بیان در سلول‌های اپیدرمی و مدل‌سازی مخلوط گاوسی وجود دو جمعیت مجزا را پشتیبانی می‌کند (G = 2؛ معیار اطلاعات بیزی دو بر یک جزء را ترجیح می‌دهد)، که با خطوط آبی و قرمز (e) نشان داده می‌شود. تعداد سلول های مو و غیر مویی اختصاص داده شده به هر جمعیت نشان داده شده است. f-h، HCR تمام کوه دو جمعیت اپیدرمی را در داخل بدن تأیید می کند. بخش نوری که تشخیص رونوشت AT3G01720 (نشانگر شاخه 2) و AT5G56550 (نشانگر شاخه 1) را در سلول‌های اپیدرمی (ستاره‌ها) نشان می‌دهد (f).

نمودار پراکندگی میانگین شدت سیگنال برای AT3G01720 و AT5G56550 (گرم) و نسبت شدت متوسط ​​AT3G01720 /( AT3G01720 + AT5G56550) (ساعت) به ازای هر بخش بندی سلول اپیدرمی 3D اندازه گیری شد. مدل‌سازی مخلوط گاوسی از وجود دو جمعیت متمایز پشتیبانی می‌کند (G = 2؛ معیار اطلاعات بیزی دو نسبت به یک جزء را ترجیح می‌دهد)، که توسط خوشه‌هایی در g و با خطوط آبی و قرمز در h نشان داده می‌شود. کمی سازی بر روی 97 سلول اپیدرمی از سه ریشه مستقل انجام شد. میله های مقیاس، 50 میکرومتر (a، f).

با هم، این خطوط مستقل از شواهد نشان می‌دهند که توپولوژی bifid یک حالت بیولوژیکی قابل تکرار را منعکس می‌کند که با فعال‌سازی یک برنامه رونویسی هماهنگ در زیرمجموعه‌ای از سلول‌ها در چندین نوع سلول ریشه مشخص می‌شود.