یک پروتئین متصل به RNA گیاهی 2',3'-cNMP تولید شده توسط عوامل حشرات را حس می کند

نوکلئوتیدهای منتهی به 2'،3'-سیکلوفسفات مشتق از RNA به عنوان مولکول های سیگنال دهنده ایمنی در پروکاریوت ها و یوکاریوت ها 1، 2، 3 عمل می کنند، اما اینکه گیاهان چگونه آنها را درک می کنند ناشناخته باقی مانده است. حشرات مکنده آنزیم های گوارشی از جمله RNase ها را برای بدست آوردن مواد مغذی به گیاه میزبان تزریق می کنند. در اینجا نشان می‌دهیم که NIB1، یک پروتئین متصل شونده به RNA غنی از گلیسین در برنج، مونوفسفات‌های نوکلئوتیدی حلقوی 2',3' (2',3'-cNMPs؛ 2',3'-cAMP و 2',3'-cGMP) و آدنیلیل-(3'→5')-2'phonicpha-Guanosine را حس می کند. (ApG>p) توسط یک ریبونوکلئاز T2 بزاقی از حشره بوی سبز در طول تغذیه تولید می شود.

اتصال محصولات RNase باعث تشکیل میعانات هسته‌ای حاوی NIB1 می‌شود، که تنظیم‌کننده اصلی ایمنی را به‌کار می‌گیرد و حساسیت بیماری ۱ (EDS1) را فعال می‌کند و دفاع را فعال می‌کند، که به طور بالقوه به سیگنال‌دهی ایمنی گیرنده Toll/اینترلوکین ۱ (TIR) ​​پروتئین‌های نوکل‌آز کمک می‌کند. کاربرد خارجی 2'،3'-cAMP، 2'،3'-cGMP یا ApG>p باعث ایجاد پاسخ های ایمنی با واسطه NIB1 و EDS1 می شود.

یافته‌های ما یک مسیر حفاظت‌شده در گیاهان را نشان می‌دهد که در آن پروتئین‌های متصل به RNA غنی از گلیسین، پیام‌رسان‌های دوم تولید شده توسط نوکلئاز را برای راه‌اندازی دفاع درک می‌کنند و به یک پیوند بالقوه بین فعالیت هسته TIR گیاه و سیگنال‌دهی EDS1 اشاره می‌کنند.

آفات حشرات باعث خسارات تولید محصول و آسیب به پوشش گیاهی می شوند 4 و 5 . در طول تغذیه، حشرات ترشحات دهانی حاوی پروتئین ها و مولکول های دیگر را آزاد می کنند که می توانند دفاع گیاه میزبان را فعال یا سرکوب کنند 6، 7، 8. آنزیم های گوارشی اجزای سلولی را برای تولید مواد مغذی برای گیاهخواران هیدرولیز می کنند. این محصولات تجزیه همچنین به عنوان الگوهای مولکولی مرتبط با آسیب مشتق از میزبان (DAMPs) عمل می‌کنند که گیرنده‌های تشخیص الگوی گیاه را فعال می‌کنند.

شناسایی مولکول‌های سیگنال‌دهنده مشتق از میزبان و مکانیسم‌های فعال‌سازی دفاعی آن‌ها برای توسعه استراتژی‌های جدید حفاظت از گیاه ضروری است.

پروتئین‌های ریبونوکلئاز خانواده T2 (RNaseT2)، که ترجیحا RNA‌های تک رشته‌ای را بین باقی مانده‌های پورین و یوریدین می‌شکافند، آنزیم‌های قدیمی هستند که به طور گسترده در بین ارگانیسم‌ها توزیع شده‌اند و در فرآیندهای بیولوژیکی متنوع عمل می‌کنند. S-RNaseهای گیاهی که واسطه خود ناسازگاری هستند به این خانواده پروتئینی تعلق دارند 12 . فیتوپاتوژن ها نیز نوکلئازها را در بافت های میزبان ترشح می کنند 13 و 14 . RNaseT2 لیزوزومی انسانی اولیگوریبونوکلئوتیدهای پایان یافته با پورین-2'،3'-سیکلوفسفات تولید می کند که توسط گیرنده Toll مانند 8 برای فعال کردن ایمنی ذاتی حس می شوند.

دامنه های گیرنده Toll/Interleukin-1 (TIR) ​​گیرنده های ایمنی متصل شونده به نوکلئوتید داخل سلولی و تکرار غنی از لوسین (NLR) دارای فعالیت های آنزیمی نسبت به نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید اکسید شده (NAD + ) و اسیدهای نوکلئیک 15، 16، 19، 18، 15 هستند. دامنه‌های TIR گیاهی، پیام‌رسان‌های دومی مانند 2'-ADPR و pRib-AMP را تولید می‌کنند که تشکیل مجتمع EDS1- Phytoalexin Deficient 4 (PAD4)-Activated Disease Resistance 1 (ADR1) را تقویت می‌کنند و باعث مقاومت در برابر بیماری می‌شوند.

TIR گیاهی فعال همچنین تولید ADPr-ATP و di-ADPR را کاتالیز می کند و منجر به تشکیل پیچیده ژن 101 مرتبط با پیری EDS1 (SAG101) - N ژن مورد نیاز 1 (NRG1) می شود که باعث مرگ سلول های گیاهی می شود 16، 22، 23. دامنه‌های TIR گیاهی نیز 2'،3'-cAMP و 2',3'-cGMP (2',3'-cAMP/cGMP) را از طریق فعالیت نوکلئاز سنتز می‌کنند. آرابیدوپسیس نودیکس هیدرولاز 7 (در NUDT7) 2'،3'-cAMP/cGMP را هیدرولیز می کند و مرگ سلولی با واسطه TIR را در هنگام بیان بیش از حد در Nicotiana benthamiana 3 کاهش می دهد. با این حال، سهم 2'،3'-cAMP/cGMP در ایمنی وابسته به EDS1 مبهم باقی مانده است.

پروتئین‌های پیوند دهنده RNA غنی از گلیسین گیاهی (GRPs) که شامل یک موتیف شناسایی RNA (RRM) در انتهای N و یک منطقه غنی از گلیسین (GRR) در انتهای C است، پاسخ‌های گیاه به تنش‌های غیرزیستی و زیستی را تنظیم می‌کنند. آرابیدوپسیس GRP7 (در GRP7) نقش مثبتی در ایمنی دارد، در حالی که عامل سودوموناس سیرنگه HopU1 با کاتالیز کردن ADP-ریبوزیلاسیون یک باقیمانده آرژنین (R49) در RRM در GRP7 26، 227، ایمنی ناشی از GRP7 را سرکوب می‌کند.

این داده ها نشان می دهد که RRM از GRP ها برای عملکرد ایمنی مرکزی است، اگرچه مکانیسم مولکولی زیربنایی ناشناس باقی مانده است. در اینجا گزارش می‌کنیم که برنج GRP NIB1 با حشره‌های مهاجم T2 RNase (مانند NVR1) برای ترویج فعالیت ریبونوکلئاز و تولید 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p تعامل دارد. اتصال به نوکلئوتیدهای حلقوی از طریق RMM، جداسازی فاز NIB1 را تحریک می کند تا ماشین آلات دفاعی گیاه در هسته جمع شود.

Nezara viridula (حشره‌ی بدبو سبز) یک آفت چند‌خوار نیم‌ترانه است که از طیف وسیعی از گیاهان، از جمله غذای مهم اقتصادی، محصولات میوه و سبزیجات و گونه‌های Nicotiana تغذیه می‌کند. جمعیت N. viridula اخیرا در مزارع برنج افزایش یافته است. به عنوان یک تغذیه کننده مزوفیل سوراخ کننده-مکنده (شکل 1a)، N. viridula از استایل‌های سوزنی مانند برای سوراخ کردن دانه‌های در حال رشد یا برگ‌های جوان، استخراج مواد مغذی و تزریق عوامل مؤثر استفاده می‌کند.

برای شناسایی آنزیم‌های ترشحی، پروتئین‌ها را در ترشحات دهانی آن با استفاده از کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS/MS) نمایه کردیم و 22 آنزیم گوارشی فرضی را شناسایی کردیم که 15 آنزیم احتمالا بر اساس پیش‌بینی پپتید سیگنال (SignalP 3.0) و (سرور داده‌ها Blasxtundan) ترشحی هستند. ). بیان گذرا این پروتئین ها در برگ های N. benthamiana یک آنزیم کاندید را شناسایی کرد که باعث مرگ شدید سلولی و تولید گونه های اکسیژن فعال (ROS) در 3 روز پس از آگرواینفیلتراسیون (dpi) شد (داده های توسعه یافته شکل 1b,c).

این پروتئین شباهت توالی بالایی به ریبونوکلئاز نشان می دهد و نام آن را N. viridula ribonuclease 1 (NVR1) گذاشتیم.

پوره سن پنجم N. viridula روی خوشه برنج (سمت چپ) و بالغ روی لوبیا قرمز (راست). b، نمودار NVR1 نشان دهنده پپتید سیگنال ترمینال N (اسیدهای آمینه 1 تا 24) پیش بینی شده توسط Signalp 3.0 و ناحیه کاتالیزوری نوکلئاز (اسیدهای آمینه 28 تا 235) پیش بینی شده توسط Pfam. H نشان دهنده باقیمانده هیستیدین فعال کاتالیزوری است. c، نشان‌واره مکان‌های فعال کاتالیزوری حفاظت‌شده (H64 و H116) در RNaseهای T2 یوکاریوتی. d، جداسازی اوره-PAGE RNA هضم شده توسط NVR1، NVR1 (H116A)، NVR1 (H64A) و NVR1 (H-doub). برای اطلاعات منبع ژل، به شکل تکمیلی 1 مراجعه کنید.

e، ساختارهای مولکولی 2'،3'-cAMP، 2'،3'-cGMP و ApG>p. f، مقایسه کروماتوگرام یونی استخراج شده محصولات NVR1 با استانداردها. دی نوکلئوتید-2'،3'-سیکلوفسفات از (UAGU) 5 تولید شد اما با (UGAU) 5 غیر قابل کشف بود. rRNA، RNA ریبوزومی. g، تعیین کمیت 2',3'-cAMP/cGMP و ApG>P در برگ برنج پس از 2 ساعت تغذیه توسط لاروهای سن سوم C. medinalis (Cm). FW، وزن تازه. h، تشخیص HPLC 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p در شرایط آزمایشگاهی با ترانسفکشن با ناقل خالی (EV) یا نوع وحشی یا جهش یافته NVR1 تولید می شود. ND، تعیین نشده است.

i، تعیین کمیت 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p در N. benthamiana 2 روز پس از بیان پروتئین مشخص شده (بردار خالی نرمال شده به 1.0) باقی می ماند. j، مرگ سلولی در برگ های N. benthamiana (3 نقطه در اینچ) ناشی از ناقل خالی یا نوع وحشی یا جهش یافته NVR1. نوارهای انباشته شده با کد رنگی، درصد هر امتیاز مرگ سلولی را نشان می دهد (0-5، n = 11 برگ). k، هیدرولیز 100 میکرومولار 2',3'-cAMP/cGMP و ApG>p توسط 1 میکرومولار فعال و جوشانده در NUDT7 در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت. l، در NUDT7 (322 اسید آمینه) مرگ سلولی ناشی از NVR1 در N را سرکوب کرد.

بنتامیانا پس از بیان همزمان به مدت سه روز برگ می زند (به صورت j نمره گذاری می شود). m، n، PCR کمی با رونویسی معکوس (RT-qPCR) MYC2 و NPR1 در خطوط NVR1 -OE (m) و NVR1 H-doub -OE (n) در مقایسه با نوع وحشی (ZH11). داده های d، f نماینده سه آزمایش مستقل هستند. داده های g – i، k، m، n میانگین ± s.d هستند. از n = 3 تکرار مستقل از نظر بیولوژیکی (h، k) یا نمونه (g، i، m، n). تفاوت های آماری با آزمون t دو طرفه (g) یا آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون توکی (h، i، k، m، n) تعیین شد.

پیش‌بینی شد که NVR1 دارای یک پپتید سیگنال ترشحی N ترمینال و بدون ناحیه گذرنده است. تجزیه و تحلیل با استفاده از پایگاه داده خانواده پروتئین (Pfam) یک دامنه ریبونوکلئاز (RNase) را نشان داد (شکل 1b) که متعلق به خانواده RNaseT2 11 است. NVR1 هم در غدد بزاقی N. viridula و هم در گیاهان برنج آلوده تشخیص داده شد، که نشان می‌دهد در طول تغذیه در بافت‌های گیاه ترشح می‌شود (داده‌های توسعه یافته شکل 1d). NVR1 یک الگوی توزیع نوکلئوسیتوپلاسمی را نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 1e).

H64 و H116 در میان T2 RNaseهای پستانداران، حشرات گیاهخوار، قارچ های بیماریزای گیاهی و گیاهان حفظ شده اند (شکل 1c و داده های توسعه یافته شکل 1f). NVR1 سرم آرابیدوپسیس tRNA نشاندار Cy5 (83 nt) را در شرایط آزمایشگاهی برش داد، در حالی که جهش‌های NVR1 (H116A) و NVR1 (H64A) به ترتیب کاهش خفیف و قوی در تخریب بستر نشان دادند، و جهش دوگانه NVR1 (H-indoub4) تقریبا به طور کامل پشتیبانی می‌کرد. H116 به عنوان باقی مانده های کاتالیزوری کلیدی 11.

متعاقبا از طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا برای شناسایی محصولات واکنش کاتالیز شده با NVR1 استفاده شد که تجمع 2',3'-cAMP و 2',3'-cGMP و همچنین یک سیکلوفسفات-2',3' با دی نوکلئوتید با نسبت جرم به بار مثبت 10/7 را نشان داد (شکل 7/5 z27). 1e,f). با توجه به اینکه ترجیحا برش RNA تک رشته ای بین پورین ها و یوریدین ها توسط RNaseT2 باعث تولید گوانوزین یا آدنوزین 2'،3'-سیکلوفسفات انتهایی 2 می شود، ما دو الیگوریبونوکلئوتید (UAGU) 5 و (UGAU) 5 را برای تعیین ساختار محصول طراحی کردیم.

NVR1 فعالیتی را به سمت (UAGU) 5 نشان داد - اما نه به سمت (UGAU) 5 - ایجاد یک پیک در 5.1 دقیقه در حالت کروماتوگرام یونی استخراج‌شده که مشابه پیک دینوکلئوتیدی-2',3'-سیکلوفسفات در m/z 675.1072، NG1-MP، تولید شده است، نشان می‌دهد که NG1-2 تولید شده است. AMP (ApG>p). استاندارد مصنوعی ApG>p که در 5.1 دقیقه با m/z 675.1072 در حالت مثبت شسته می شود، با محصول NVR1 (شکل 1f) همسو می شود و با طیف جرم پشت سر هم (MS 2) مطابقت دارد (داده های توسعه یافته شکل 1g).

تجمع 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>P به سرعت در برگ های برنج در عرض 2 ساعت پس از تغذیه حشرات القا شد (شکل 1g).

فعالیت سنتاز 2',3'-cNMP و ApG>p NVR1 به دو هیستیدین کاتالیزوری H64 و H116 وابسته بود (شکل 1h). کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) - طیف‌سنجی جرمی و تحلیل دفع/یونیزاسیون لیزری به کمک ماتریس (MALDI) نشان داد که برگ‌های N. benthamiana که بردار خالی یا جهش‌های NVR1 غیرفعال کاتالیزوری را بیان می‌کنند، 2',3'-MPld و AMP-cAMP>c را بیان می‌کنند. NVR1 (شکل 1i و داده های توسعه یافته شکل 1h). برگ‌هایی که جهش‌یافته‌های NVR1 را بیان می‌کنند در القای مرگ سلولی گیاهی دچار اختلال شدند (شکل 1j و داده‌های توسعه‌یافته شکل 1i).

در NUDT7 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p هیدرولیز شد (شکل 1k). بیان همزمان با NUDT7 فعالیت مرگ سلولی NVR1 را در N. benthamiana در dpi 3 کاهش داد، با نکروز کامل در 6 dpi (شکل 1l و داده های توسعه یافته شکل 1j,k). این نتایج نشان می دهد که فعالیت آنزیمی NVR1 باعث مرگ سلول های گیاهی می شود.

برای بررسی پاسخ گیاه به آفت RNase، ما گیاهان تراریخته برنج NVR1-GFP تولید کردیم که NVR1-GFP را بیش از حد بیان می کنند (داده های توسعه یافته شکل 2a,b). تجزیه و تحلیل توالی RNA (RNA-seq) نشان داد که ژن های مرتبط با محرک های زیستی، اسید جاسمونیک و دفاع به طور قابل توجهی در گیاهان بیان کننده NVR1 غنی شده اند (داده های توسعه یافته شکل 2c). MYC2، NPR1، COI1 و ERF1 (شکل 1m و داده های توسعه یافته شکل 2d) تنظیم مثبت شد و سطوح اسید جاسمونیک و اسید سالیسیلیک افزایش یافت (داده های توسعه یافته شکل 2e).

Cnaphalocrocis medinalis ribonuclease 1 (CMR1)، یک ارتولوگ NVR1 بیان شده توسط Cnaphalocrocis medinalis -یک آفت لپیدوپتر برنج- در ترشحات دهانی شناسایی شد و همچنین 2',3'-cAMP/cGMP را تولید کرد. داده های تغذیه برگ (شکل 1g). با توجه به این حفاظت عملکردی، ما مقاومت خطوط تراریخته NVR1 را به C. medinalis ارزیابی کردیم. لاروها در گیاهان بیان کننده NVR1 نسبت به شاهد وزن کمتری به دست آوردند (داده های توسعه یافته شکل 2h).

ماده های بالغ تخم های کمتری روی لاین های تراریخته NVR1 گذاشتند و لاروها ترجیح دادند از گیاهان شاهد تغذیه کنند.

گیاهان بیان‌کننده NVR1 متوقف شدند و پنجه‌های کمتری تولید کردند، فنوتیپ‌های مرتبط با هزینه رشد فعال‌سازی دفاعی سازنده، در حالی که گیاهان برنج که NVR1 (H-doub) غیرفعال کاتالیزوری را بیان می‌کردند، ژن‌های دفاعی را تنظیم نکردند و به طور طبیعی رشد کردند (شکل 1n و داده‌های توسعه‌یافته شکل 2k). این نتایج نشان می‌دهد که بیان هترولوگ NVR1 در برنج باعث واکنش‌های دفاعی و افزایش مقاومت گیاه به تغذیه حشرات می‌شود و فعالیت کاتالیزوری NVR1 برای فعال‌سازی ایمنی ضروری است.

برای کشف مکانیسم‌های مولکولی زیربنای پاسخ دفاعی گیاه ناشی از NVR1، پروتئین‌های گیاهی را که می‌توانند با رسوب ایمنی و طیف‌سنجی جرمی (IP-MS) به NVR1 متصل شوند، غربال کردیم. پروتئین 1 متصل کننده RNA با تعامل NVR1 (NIB1 (Os03t0670700-04)، همچنین به عنوان Os GRP3 30، 31 شناخته می شود) یک سیگنال برهمکنش قوی را نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 3a,b). NIB1 یک GRP است که از یک RRM ترمینال N و یک GRR ترمینال C تشکیل شده است و 80٪ هویت توالی N ترمینال را با GRP7 26، 27 به اشتراک می گذارد (داده های توسعه یافته شکل 3c).

ترموفورز در مقیاس میکرو (MST) نشان داد که NIB1 مستقیما با NVR1 در شرایط آزمایشگاهی برهمکنش دارد (شکل 2a و داده های توسعه یافته شکل 3d)، و رسوب همزمان ایمنی برهمکنش را در پلانتا تایید کرد (شکل 2b).

یک سنجش MST که تعامل NHS-NVR1-factor trigger (TF) با RRM NIB1 (NIB1 RRM) را در شرایط آزمایشگاهی نشان می‌دهد. K d ثابت تفکیک است. b، NVR1-YFP با NIB1-Flag در یک سنجش هم‌رسوبی ایمنی تعامل دارد. برای اطلاعات منبع ژل، به شکل تکمیلی 1 مراجعه کنید. IP، رسوب ایمنی. ج، تشخیص طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا 2',3'-cAMP/cGMP و ApG>p گرفته شده با NIB1 از محصولات کاتالیز شده با NVR1 پس از انکوباسیون با NIB1-GST (100 میکروگرم) به مدت 1 ساعت. بردار خالی با برچسب TF به عنوان کنترل منفی عمل کرد. d، مدلسازی ساختاری 2',3'-cAMP/cGMP و ApG>p در NIB1.

NIB1 2',3'-cAMP/cGMP را از طریق R49 و G50 و ApG>p را از طریق R49، G50، G14 و W17 متصل می کند. e، آزمون MST که اتصال 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p توسط NIB1 و جهش یافته‌های آن را نشان می‌دهد. f، NIB1-YFP در منطقه ازدیاد طول ریشه خطوط تراریخته T1 pNIB1::NIB1-YFP/ZH11 میعان می‌شود، پس از 6 ساعت تغذیه توسط لاروهای سن سوم C. medinalis. درست است، کمی کردن میعانات در هر هسته. g، چپ، NVR1 تشکیل میعانات هسته‌ای حاوی NIB1 را در برگ‌های N. benthamiana، با قدرت 48 اسب بخار، ترویج کرد. بردار خالی به عنوان کنترل استفاده شد. میله های مقیاس، 5 میکرومتر.

درست است، کمی کردن میعانات در هر هسته. ساعت، سمت چپ، 2'،3'-cNMP (2 نانومولار) جداسازی فاز NIB1 را القا کرد، اما موتانت‌های اتصال‌دهنده (هر 20 میکرومولار)، در شرایط آزمایشگاهی. راست، قطر قطرات نسبی (PBS به 1.0 نرمال شد). میله های مقیاس، 10 میکرومتر. i، j، تصاویر (i) و کمی سازی (j) میعانات هسته ای NIB1 در برگ های N. benthamiana پس از 2 ساعت درمان با 8-Br - 2'،3'-cAMP/cGMP (50 میکرومولار). میله های مقیاس، 5 میکرومتر. k، چپ، NIB1-YFP میعانات در منطقه ازدیاد طول ریشه خط برنج T1 pNIB1::NIB1-YFP/ZH11 پس از 6 ساعت درمان با 50 میکرومولار 8-Br-2',3'-cAMP یا 8-Br-2',3'-cGMP می شود.

درست است، کمی کردن میعانات در هر هسته. میله های مقیاس در f و k، 10 میکرومتر (بالا) و 3 میکرومتر (پایین). داده ها میانگین ± s.d. n = 3 تکرار مستقل از نظر بیولوژیکی (a، e)، 7 هسته (f، g، k)، 20 قطره (h) یا 5 هسته (j). آنالیزهای آماری از آنالیز واریانس دو طرفه با آزمون تعقیبی توکی (f، h، j) یا آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی (g، k) استفاده کردند. آزمایشات در b و c به طور مستقل سه بار با نتایج مشابه تکرار شد.

مکمل لوسیفراز تقسیم شده (SLC) نشان داد که NIB1 RRM، اما نه GRR، با NVR1 (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3e) برهم‌کنش داشت و با داده‌های MST مطابقت داشت (شکل 2a). AlphaFold2 باقیمانده RRM R22 را به عنوان یک مکان تماس پیش‌بینی کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3f)، و جهش‌یافته NIB1(R22A) برهم‌کنش را در پلانتا لغو کرد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3g). NVR1 به شدت با NIB1، مستقل از فعالیت کاتالیزوری آن تعامل داشت (داده های توسعه یافته شکل 3h-j).

با توجه به اینکه ریبونوکلئازهای ترشحی T2 شبیه NVR1 در حشرات و قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی گسترده هستند (داده‌های توسعه یافته شکل 1f)، و GRP‌ها در سراسر گیاهان خشکی حفظ می‌شوند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3k)، ما بررسی کردیم که آیا پدیده متقابل RNaseT2-GRP رایج است یا خیر. ما RNases T2 ترشح شده از آفات حشره C. medinalis (CMR1) و Helicoverpa armigera (HAR1) و پاتوژن قارچی Magnaporthe oryzae (MOR1) را آزمایش کردیم. سنجش SLC نشان داد که تشخیص RNaseهای خانواده T2 توسط GRPهای گیاهی جهانی است (داده های توسعه یافته شکل 3l,m).

با توجه به اینکه GRP به قطعات RNA 27 متصل می شود و NVR1 به فعالیت RNase آن برای ایجاد دفاع نیاز دارد، ما اتصال بالقوه NIB1 به محصولات RNaseT2 را بررسی کردیم. NIB1-GST با محصولات NVR1 انکوبه شد، برای استخراج مولکول‌های متصل دناتوره شد و توسط طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا آنالیز شد. قابل توجه، سیگنال های با شدت بالا 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p مشاهده شد (شکل 2c). مدلسازی ساختاری NIB1 با لیگاندها، دو باقیمانده مجاور را در حلقه دامنه RRM، R49 و G50 شناسایی کرد که مسئول تشخیص 2'،3'-cAMP/cGMP بودند (شکل 2d و داده های توسعه یافته شکل 4a).

R49 یک محل اتصال RNA شناخته شده 27 است، در حالی که G50 هر دو 2'،3'-cAMP و 2',3'-cGMP در مدل ما تماس دارد. G14 و W17 به عنوان سایت های شناسایی اضافی برای ApG>p خدمت می کنند (شکل 2d و داده های توسعه یافته شکل 4a). در سنجش MST با 2'،3'-cAMP/cGMP و ApG>p، NIB1 نشاندار NHS میل اتصال بالایی را نشان داد. جایگزینی هر یک از باقیمانده ها با آلانین (NIB1(R49A) یا NIB1(G50A)) به طور قابل توجهی میل اتصال را کاهش داد، و جهش NIB1 (R49A/G50A/G14A/W17A) (از این پس NIB1(4A)) به طور کامل جهش را لغو کرد (شکل 2) 3 بعدی).

G14، W17، R49 و G50 در گروهی از GRP ها در سراسر گیاهان زمینی به شدت محافظت می شوند (داده های توسعه یافته شکل 3n)، که حاکی از نقش حیاتی این باقیمانده ها در شناسایی لیگاند است. جهش NIB1 (R49A) اتصال NIB1 به هر دو RNA و نوکلئوتیدهای 2'،3 حلقوی را مختل کرد، در حالی که جهش NIB1 (G50A) میل اتصال به FLAGELIN SENSITIVE2 (FLS2) 3' ناحیه ترجمه نشده (UTR) را حفظ کرد و در عین حال دو چرخه ای قوی را نشان داد. (داده های توسعه یافته شکل 4b). بنابراین، NIB1 مکانیسم‌های تشخیص مشترک و در عین حال متمایز را برای 2'،3'-cAMP/cGMP و RNA به کار می‌گیرد.

در سنجش MST با استفاده از 2'،3'-cAMP به عنوان یک کنترل مثبت، NIB1 3'،5'-cAMP، 8-Br-3'،5'-cAMP، AMP یا 2',3'-cGAMP 32 را متصل نکرد (داده های توسعه یافته شکل 4c-g). NIB1 به ترتیب برای 3'،5'-cGMP و GMP قرابت اتصال 4 برابر و 34 برابر ضعیف تری را در مقایسه با 2'،3'-cGMP نشان داد (شکل 2e و داده های توسعه یافته شکل 4h,i).

NIB1 حاوی یک ناحیه بی نظم ذاتی ترمینال C (IDR) (داده های توسعه یافته شکل 5a) است که جداسازی فاز را واسطه می کند 33 . PONDR میانگین نمره اختلال بالای مشابه با GRP7 را پیش بینی کرد (داده های توسعه یافته شکل 5b). در شرایط آزمایشگاهی، NIB1-YFP قطراتی را تشکیل داد که بازیابی فلورسانس را پس از سفیدکردن نوری (FRAP) نشان داد و برای تشکیل قطرات بزرگ‌تر ذوب شد (داده‌های توسعه یافته شکل 5c-e). سیگنال‌های NIB1–YFP نیز پس از سفید کردن نور در برگ‌های N. benthamiana بازیابی شدند (داده‌های توسعه یافته شکل 5f).

برای تعیین اینکه آیا گیاه خواری باعث ایجاد تراکم NIB1 در گیاه می شود، ما دو خط برنج pNIB1::NIB1-YFP /ZH11 تولید کردیم (داده های توسعه یافته شکل 5g). پس از 6 ساعت تغذیه توسط لاروهای سن سوم C. medinalis، میعانات هسته ای متمایز NIB1 به وضوح مشاهده شد (شکل 2f)، که نشان می دهد این جداسازی فاز یک پاسخ فیزیولوژیکی مرتبط به گیاه خواری است. مشابه مشاهدات در شرایط آزمایشگاهی و در هسته های N. benthamiana، میعانات NIB1-YFP در هسته های pNIB1::NIB1-YFP /ZH11 فلورسانس را پس از سفید کردن نور بازیابی کردند (داده های توسعه یافته شکل 5h).