NRF2 یک نقطه بازرسی مکانیکی برای فعال سازی التهاب NLRP3 است

قطع ارتباط بین نتایج in vitro و in vivo در زیست شناسی تجربی به مدت طولانی به عنوان موانع بالقوه برای درک سلامت و بیماری شناخته شده است. یک نمونه اولیه از چنین قطع ارتباط، التهاب NLRP3 است که واسطه التهاب در تنظیمات مختلف بیماری و ایمنی محافظتی است. فعال سازی التهابی NLRP3 در شرایط آزمایشگاهی به دو سیگنال نیاز دارد: (1) پرایمینگ توسط الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن مانند لیپوپلی ساکاریدهای باکتریایی و (2) فعال شدن توسط مولکول هایی که هموستاز سلولی را مختل می کنند 1، 3.

در مقابل، التهاب NLRP3 در داخل بدن تنها توسط لیپوپلی ساکارید فعال می شود. مکانیسم هایی که زمینه ساز تفاوت بین فعال سازی in vitro و in vivo التهاب NLRP3 هستند، تعریف نشده اند. در اینجا ما گزارش می‌کنیم که سفتی ماتریکس خارج سلولی (ECM) تعیین‌کننده فعالیت‌های NLRP3 است و سیستم‌های آزمایشگاهی با استفاده از سفتی فیزیولوژیکی ECM، فعالیت‌های NLRP3 یک سیگنال در داخل بدن را قادر می‌سازد تا در فاگوسیت‌های انسان و موش رخ دهد. سفتی فیزیولوژیکی ECM باعث بیان فاکتور رونویسی NRF2 شد که مشخص شد برای فعال‌سازی یک سیگنال NLRP3 ضروری است.

از نظر مکانیکی، ما Panx1 را به عنوان یک ژن تنظیم‌شده با NRF2 شناسایی می‌کنیم که فعالیت NLRP3 را ارتقا می‌دهد. ماکروفاژهای مشتق شده از ماتریکس سفت استخوان - استئوکلاست ها - سطوح NRF2 را کاهش داده و فعالیت NLRP3 را مختل کرده بودند. علاوه بر این، ماکروفاژهای آلوئولی از بیماران مبتلا به فیبروز ریوی کاهش فعالیت NRF2 را نشان دادند. در نهایت، NRF2 برای ایمنی ضد توموری ناشی از واکسن‌های سرطان متشکل از ادجوانت‌های آگونیست NLRP3 مورد نیاز بود. این یافته ها نشان می دهد که NRF2 ممکن است یک نقطه بازرسی رونویسی باشد که فعالیت التهابی NLRP3 را کنترل می کند.

Inflammasome ها اندامک های سیتوپلاسمی هستند که واکنش های التهابی به عفونت و آسیب را، عمدتا از طریق برش و آزادسازی خانواده اینترلوکین-1 (IL-1) از سیتوکین ها، واسطه می کنند. پروتئین‌های متنوعی می‌توانند مجموعه‌های التهابی را ایجاد کنند، با NLRP3 که بهترین مشخصه و شایع‌ترین آنها با بیماری‌های انسانی است. فعال سازی NLRP3 در شرایط آزمایشگاهی به دو سیگنال نیاز دارد 1 . سیگنال 1 توسط الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن مانند لیپوپلی ساکارید باکتریایی (LPS) ارائه می شود که مسیر NLRP3 را برای پاسخگویی به محرک های بعدی حساس می کند (یعنی اولیه می کند).

سیگنال 2 می تواند توسط مجموعه متنوعی از محرک ها ارائه شود، که همگی برهمکنش های بین NLRP3 و پروتئین ASC را القا می کنند، که منجر به جذب و فعال سازی کاسپاز-1 می شود (مراجعه 1، 4). کمپلکس NLRP3-ASC-کاسپاز-1 نشان دهنده حداقل اجزای التهابی NLRP3 است. کاسپاز-1 فعال در التهاب زاوم، پرو-IL-1β و پروتئین منافذ ساز گادرمین D (GSDMD) را می شکافد، که منجر به آزادسازی IL-1β فعال زیستی (IL-1β p17) و پیروپتوز 5، 6، 7، 8 می شود.

اگرچه این مدل دو سیگنالی برای فعال سازی NLRP3 در شرایط آزمایشگاهی صادق است، LPS به تنهایی برای فعال کردن NLRP3 در داخل بدن کافی است 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. توضیحی برای اختلاف بین فعال‌سازی NLRP3 در شرایط in vitro و in vivo مبهم است و در اینجا مورد بررسی قرار گرفت.

ما سینتیک فعال سازی NLRP3 را در داخل بدن پس از تزریق داخل صفاقی (i.p.) LPS به موش بررسی کردیم. تزریق LPS باعث تجمع وابسته به NLRP3 IL-1β در سرم در عرض 3 ساعت شد (داده های توسعه یافته شکل 1a,b). کاسپاز-11 تنظیم کننده تولید IL-1β ناشی از LPS در داخل بدن است. کاسپاز-11 برای تجمع IL-1β در سرم 3 ساعت پس از تزریق LPS غیرقابل استفاده بود اما برای تولید IL-1β 6 ساعت پس از تزریق LPS مورد نیاز بود (داده های توسعه یافته شکل 1c). این داده ها نشان می دهد که LPS می تواند NLRP3 را به سرعت و مستقل از کاسپاز-11 فعال کند.

در عرض 1 ساعت از تزریق LPS، IL-1β شکاف در مایع صفاقی تشخیص داده شد (شکل 1a,b). موش های Nlrp3 -/- IL-1β را پس از تزریق LPS در مایع صفاقی تجمع نکردند (داده های توسعه یافته شکل 1d). سرعت تولید IL-1β p17 مشاهده شده در مایع صفاقی نشان می دهد که مجموعه ای از سلول های ساکن مسئول هستند. ماکروفاژهای صفاقی را با استفاده از لیپوزوم های کلودرونات 17 تخلیه کردیم که منجر به از دست رفتن 99.8 درصد از این سلول ها شد (داده های توسعه یافته شکل 1e). تحت این شرایط، i.p. تزریق LPS حداقل تولید IL-1β را القا کرد (شکل 1c).

با این حال، تحریکات LPS خارج از بدن ماکروفاژهای صفاقی ساکن جدا شده، تولید IL-1β را از این سلول ها القا نکرد (داده های توسعه یافته شکل 1f). در مقابل، LPS ترشح TNF را از ماکروفاژهای صفاقی کشت شده در شرایط خارج از بدن القا می کند (داده های توسعه یافته شکل 1g). این داده‌ها نشان می‌دهند که ماکروفاژهای صفاقی در پاسخ به درمان LPS، IL-1β را در داخل بدن ترشح می‌کنند، اما این قابلیت را در شرایط in vivo از دست می‌دهند.

a، b، کمی سازی IL-1β ELISA (a) و بلات های رسوب ایمنی (IP) (b) مایع صفاقی از موش های تحت درمان با i.p. تزریق LPS یا PBS (10 موش در هر گروه). هر خط نشان دهنده یک موش است (لکه نماینده دو آزمایش مستقل است). ج، تعیین کمیت IL-1β ELISA مایع صفاقی از موش‌های تحت درمان با کلودرونات یا لیپوزوم‌های کنترل و سپس تیمار با PBS یا LPS به مدت 3 ساعت (n = 9 برای لیپوزوم‌های کنترل + LPS؛ n = 10 موش برای همه شرایط دیگر).

d، IL-1β IP بلات از رویی کشت ماکروفاژهای صفاقی کشت داده شده بر روی صفحات با سفتی متغیر و تحت درمان با LPS به مدت 6 ساعت با یا بدون ATP به مدت 30 دقیقه (یک آزمایش نماینده از چهار نشان داده شده است). e، f، تعیین کمیت IL-1β ELISA از رویی کشت BMDMs رشد کرده روی سفتی نشان‌داده‌شده ECM (e) یا به‌دست‌آمده از موش‌هایی با ژنوتیپ‌های نشان‌داده‌شده (f) و تحت درمان با یا بدون LPS به مدت 6 ساعت (تعداد = 4 آزمایش مستقل).

g، BMDMها روی صفحات سختی متغیر با LPS درمان شدند و اجزای مختلف سیگنال دهی TLR با بلات مورد بررسی قرار گرفتند (یک آزمایش نماینده از سه آزمایش نشان داده شده است). ساعت، BMDM های کشت شده در شرایط ECM نشان داده شده برای بیان NLRP3 مورد بررسی قرار گرفتند (یک آزمایش نماینده از سه آزمایش نشان داده شده است). i، j، BMDM های کشت شده در شرایط ECM نشان داده شده (i) یا به دست آمده از موش های ژنوتیپ های نشان داده شده (j) با یا بدون LPS به مدت 4 ساعت و سپس ATP به مدت 2 ساعت تحت درمان قرار گرفتند.

سوپرناتانت ها و لیزات برای پروتئین های نشان داده شده در ایمونوبلات مورد سنجش قرار گرفتند (یک آزمایش نماینده از سه یا چهار آزمایش نشان داده شده است). k، تعیین کمیت IL-1β ELISA از رویی کشت MDMهای انسانی که روی صفحات سختی متغیر کشت شده و با LPS به مدت 6 ساعت (n = 4 اهداکننده جداگانه) تیمار شده‌اند. l، IL-1β IP سوپرناتانت های کشت MDM های انسانی که به صورت k اندود شده و با یا بدون MCC950 تیمار شده اند (یک آزمایش نماینده از سه آزمایش نشان داده شده است). داده ها میانگین ± s.e.m هستند. (a، c، e، f، k).

معنی‌داری با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) با آزمون مقایسه چندگانه Dunnett's T3 (a)، آنالیز واریانس دو طرفه با آزمون تفاوت حداقل معنی‌دار فیشر (c, f) یا آنالیز واریانس دو طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی (e, k) تعیین شد. FL، تمام طول؛ NT، N پایانه.

یک تمایز بین روش‌های تجربی مورد استفاده در شرایط آزمایشگاهی و درون تنی، ECM است. بافت نرمال دارای سفتی 1-10 کیلو پاسکال (کیلو پاسکال) است، در حالی که ظروف پتری پلاستیکی دارای سفتی 3000000 کیلو پاسکال 18، 19، 20 هستند. ماکروفاژها توانایی حس کردن و انطباق با سفتی ECM را دارند 21، 22، 23، 24، 25، 26. برای تعیین اثر سفتی ECM بر فعالیت‌های التهابی NLRP3، ما سفتی ECM را که ماکروفاژها روی آن کشت می‌شوند، تغییر دادیم.

ما ظروف پتری پلاستیکی را با پلی‌دی‌متیل سیلوکسان برای مدل‌سازی سفتی بافت معمولی (صفحات نرم، 2 کیلو پاسکال) و بافت فیبروتیک (صفحات سفت، 32 کیلو پاسکال) انتخاب کردیم و از ظروف پتری پلاستیکی به‌عنوان کنترل (صفحات پلاستیکی، 3000000 کیلو پاسکال) 19، 27 استفاده کردیم. صفحات از طریق جذب فیبرونکتین بر روی سطح عامل دار شدند. ماکروفاژهای صفاقی مقیم جدا شده روی سطوحی که سفتی بافت طبیعی را تقلید می‌کنند، کشت داده شده‌اند، توانایی شبیه به in vivo را برای آزادسازی IL-1β بریده شده در پاسخ به LPS به تنهایی نشان دادند (شکل 1d).

این توانایی برای تولید IL-1β با افزایش سفتی ECM کاهش یافت (شکل 1d). یافته های مشابهی با ماکروفاژهای مشتق از مغز استخوان موش (BMDMs) مشاهده شد. BMDMهای کشت شده روی صفحات نرم (اما نه پلاستیکی) باعث انتشار IL-1β وابسته به NLRP3 شدند (شکل 1e,f). هیچ اثری از سفتی ECM بر فراوانی پروتئین NLRP3 یا بر روی فعال‌سازی مسیرهای MAP کیناز تحریک‌شده با LPS مشاهده نشد (شکل 1g,h). افزایش فسفوریلاسیون NF-kB p65 در BMDMهای رشد یافته روی ECM نرم و سفت در مقایسه با پلاستیک وجود داشت، اما این نتیجه با ترشح IL-1β ارتباط نداشت (شکل 1e,g).

در BMDM های کشت شده روی ECM نرم، LPS برای تحریک تولید و برش pro-IL-1β، برش کاسپاز-1 و برش و الیگومریزاسیون GSDMD کافی بود (شکل 1i,j). به استثنای تولید pro-IL-1β (که از طریق TLR4 انجام می‌شود)، تمام این فعالیت‌های مرتبط با التهاب کاهش یافته یا وجود نداشتند زیرا سفتی ECM به پلاستیک افزایش یافت. انتشار IL-1β ناشی از LPS در ECM نرم به NLRP3 نیاز دارد اما به کاسپاز-11 نیاز ندارد (شکل 1f و داده های توسعه یافته شکل 1h).

این داده ها حساسیت انتخابی مسیر NLRP3 را به تغییرات در سفتی ECM برجسته می کند.

سنجش‌های مشابهی با استفاده از ماکروفاژهای مشتق از مونوسیت‌های انسانی (MDM) انجام شد. MDM های انسانی کشت شده بر روی ECM نرم، IL-1β را در پاسخ به LPS تولید کردند (شکل 1k و داده های توسعه یافته شکل 1i). مهار NLRP3 با استفاده از ماده شیمیایی MCC950 (مرجع 28) از تولید IL-1β بریده شده جلوگیری کرد (شکل 1l و داده های توسعه یافته شکل 1j). در مونوسیت‌های انسانی، LPS می‌تواند تولید IL-1β را از طریق NLRP3 از طریق فرآیندی که نسبت به مهار جریان پتاسیم حساس نیست، افزایش دهد.

تحریک LPS در حضور غلظت های بالای پتاسیم خارج سلولی، روشی برای جلوگیری از خروج پتاسیم انجام شد. تحت این شرایط، تولید IL-1β ناشی از LPS مهار شد (داده های توسعه یافته شکل 1k). بنابراین ابزاری که ماکروفاژها ECM نرم را به فعال سازی NLRP3 پیوند می دهند، از رفتار مونوسیت های انسانی متمایز است.

ما تعیین کردیم که چه مدت ماکروفاژها باید با سفتی ECM سازگار شوند قبل از اینکه تولید IL-1β ناشی از LPS مشاهده شود. تحریک LPS BMDMهای کشت شده بر روی ECM نرم به مدت 16 ساعت باعث تولید IL-1β شد (شکل 1e,f)، در حالی که تحریک BMDMهای کشت شده بر روی ECM نرم به مدت 2 ساعت این کار را انجام نداد (داده های توسعه یافته شکل 2a). برای تعیین اینکه آیا ماکروفاژها به فعل و انفعالات با واسطه اینتگرین نیاز دارند یا خیر، ما BMDM ها را روی ECM نرم پوشیده شده با فیبرونکتین (برای تسهیل برهمکنش های اینتگرین) یا پلی لیزین (برای تسهیل برهمکنش های مبتنی بر بار) کشت دادیم.

ماکروفاژهای کشت شده روی پلی لیزین علیرغم ترشح IL-6 هنگام تحریک با LPS IL-1β تولید نکردند. برای تعیین اینکه آیا چسبندگی لازم است، BMDM ها را در سوسپانسیون کشت داده و آنها را با سلول های چسبیده به صفحات پلاستیکی مقایسه کردیم. سلول های موجود در سوسپانسیون وقتی با LPS تحریک شدند، IL-1β ترشح نکردند، اما واکنش خود را به LPS + ATP حفظ کردند (داده های توسعه یافته شکل 2d). بنابراین، ماکروفاژها ممکن است برای انطباق با سفتی ECM به چسبندگی چند ساعته با واسطه اینتگرین نیاز داشته باشند.

ما توالی RNA BMDMهای کشت شده روی ECM با سفتی متغیر را برای 2 ساعت یا یک شب (16 ساعت) انجام دادیم. BMDMهای کشت داده شده به مدت 2 ساعت بدون توجه به سفتی ECM از نظر رونویسی مشابه بودند (داده های توسعه یافته شکل 2e). BMDMهایی که یک شبه کشت داده شدند، تفاوت های وابسته به سفتی را در بیان ژن نشان دادند (داده های توسعه یافته شکل 2e). تجزیه و تحلیل بیان ژن دیفرانسیل BMDM های کشت شده در یک شب، چندین صد ژن القا شده بر روی ECM نرم و سرکوب شده روی پلاستیک را نشان داد (شکل 2a).

تجزیه و تحلیل مسیر ابتکاری ژن‌های القا شده فقط در ECM نرم، مسیر پاسخ استرس با واسطه NRF2 را به عنوان یک ضربه بالا شناسایی کرد (شکل 2b,c).

a، Heatmap ژن‌های با مقیاس z به طور قابل‌توجهی از توالی‌یابی RNA BMDM‌های کشت‌شده روی صفحات سختی متغیر (n = 5-6 تکرار فنی در هر شرایط) تنظیم مثبت کرد. b , c , مسیرهای متعارف ( b ) و تنظیم کننده های بالادستی ( c ) با استفاده از تجزیه و تحلیل مسیر ابتکاری ژن ها از a شناسایی شدند. d، لکه‌های پروتئین‌های WT و Nfe2l2 -/- BMDM که روی صفحات نرم و پلاستیکی اندود شده و در معرض شکنش هسته‌ای سیتوپلاسمی قرار می‌گیرند (بلات نشان داده شده نشان‌دهنده سه آزمایش مستقل است).

e، RT-qPCR ژن‌های هدف NRF2 در BMDM‌های کاشته شده روی صفحات سختی متغیر (n = 3 در هر گروه، نتایج نشان‌دهنده سه آزمایش مستقل). f، نقشه حرارتی ژن‌های با مقیاس z که به طور قابل‌توجهی متفاوت بیان می‌شوند از توالی‌یابی RNA WT و Nfe2l2 -/- BMDM‌های کاشته‌شده روی صفحات نرم و پلاستیکی (n = 3 آزمایش مستقل). g، کمی سازی IL-1β ELISA از رویی کشت سلولی از WT و Nfe2l2 -/- BMDMs روی صفحات نرم اندود شده و با LPS به مدت 6 ساعت (تعداد = 4 آزمایش مستقل) تحت درمان قرار گرفتند.

ساعت، تعیین کمیت IL-1β ELISA سرم از موش های WT و Nfe2l2 -/- تحت درمان با PBS یا LPS به مدت 3 ساعت (n = 5 موش برای موش WT تحت درمان با PBS، n = 10 موش برای هر یک از شرایط دیگر). i، تعیین کمیت IL-1β ELISA از رویی کشت سلولی از Keap1 f/f و Keap1 ∆M BMDM که روی صفحات پلاستیکی اندود شده و با LPS به مدت 24 ساعت (n = 4 آزمایش مستقل) تیمار شده‌اند. j، IL-1β IP از رویی کشت سلولی Keap1 f/f و Keap1 ∆M BMDM از i (یک آزمایش نماینده از سه آزمایش نشان داده شده است).

k، تعیین کمیت IL-1β ELISA از رویی کشت سلولی از Keap1 f/f و Keap1 ∆M BMDM روی صفحات پلاستیکی اندود شده و با LPS به مدت 24 ساعت با یا بدون MCC950 (n = 3 آزمایش مستقل) تیمار شده است. داده ها میانگین ± s.e.m هستند. (e، g – i، k). اهمیت با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی (e, g, i, k) یا آنالیز واریانس یک طرفه با آزمون مقایسه چندگانه توکی (h) تعیین شد.

اگرچه ما تغییرات وابسته به سفتی ECM را در بیان Nfe2l2 (که NRF2 را کد می کند) مشاهده نکردیم، BMDM های کشت شده روی ECM نرم حاوی بالاترین مقدار NRF2 هسته ای در مقایسه با سلول های کشت شده روی ECM سختی بالا بودند (شکل 2d و داده های توسعه یافته شکل 2f). افزایش تجمع هسته ای NRF2 با بالاترین بیان ژن های هدف NRF2 همراه بود (شکل 2e). YAP و TAZ فعال‌کننده‌های رونویسی حساس مکانیکی هستند 21، 22، 23، با این حال ما نمی‌توانیم بیان Yap1 یا Wwtr1 (که TAZ را کد می‌کند) در BMDMs شناسایی کنیم، و پروتئین YAP1 را در لیزات BMDM نمی‌توانیم تشخیص دهیم.

علاوه بر این، تجزیه و تحلیل ژن‌های هدف YAP ارتباط بین سفتی ECM و بیان ژن را نشان نداد (داده‌های توسعه یافته شکل 2g). بنابراین NRF2، اما نه YAP یا TAZ، می تواند به عنوان یک فاکتور پاسخ سختی ECM در ماکروفاژها در نظر گرفته شود. ما توالی RNA BMDM های به دست آمده از موش های نوع وحشی (WT) و Nfe2l2 - / - را انجام دادیم و روی ECM نرم یا پلاستیکی کشت داده شدیم. کل برنامه رونویسی وابسته به سختی (n = 231 ژن) در BMDMها به Nfe2l2 به جز دو ژن Egr2 و Trim30c نیاز دارد (شکل 2f). بنابراین NRF2 برای سازگاری ماکروفاژها با تغییرات سفتی ECM مورد نیاز است.

مطالعاتی که نقش NRF2 را در فعالیت های NLRP3 بررسی کرده اند گزارش شده است. به عنوان مثال، آگونیست‌های NRF2 با مولکول کوچک می‌توانند به طور منفی تولید IL-1β را تنظیم کنند. تولید IL-1β 46، 47، 48. ما اثرات پنج فعال کننده شیمیایی NRF2 (4-octyl itaconate، dimethyl fumarate، sulforaphane، tert-butylhydroquinone و KI696) را بر بیان ژن مورد بررسی قرار دادیم. تمام آگونیست‌های NRF2 بخشی از ژن‌های تحریک‌شده با LPS را سرکوب کردند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3a).

با این حال، این فعالیت سرکوب‌کننده بر بیان ژن القا شده با LPS در BMDM-های WT و Nfe2l2 رخ داد. به عنوان مثال، درمان با آگونیست های NRF2 بیان Il1b ناشی از LPS را به طور مساوی در BMDM های WT و Nfe2l2 -/- کاهش داد (داده های توسعه یافته شکل 3b). بنابراین فعال‌کننده‌های NRF2 ممکن است اثرات خارج از هدف را نشان دهند.

تجزیه و تحلیل Nfe2l2 -/- BMDMs نشان داد که NRF2 برای آزادسازی IL-1β (اما نه تولید pro-IL-1β) توسط BMDM های تحریک شده با LPS رشد یافته روی ECM نرم (شکل 2g و داده های توسعه یافته شکل 3c) مورد نیاز است. علاوه بر این، i.p. تزریق LPS در موش های Nfe2l2 -/- منجر به کاهش سطح IL-1β در سرم شد، در حالی که تجمع TNF تحت تأثیر قرار نگرفت (شکل 2h و داده های توسعه یافته شکل 3d). موشهای Nfe2l2-/- همچنین کاهش جذب نوتروفیل صفاقی را پس از داخل صفاقی نشان دادند. تزریق آلوم آگونیست NLRP3، در حالی که هیچ تفاوتی بعد از داخل صفاقی مشاهده نشد.

تزریق کریستال های اورات مونوسدیم (MSU)، که NLRP3 را نیز آزار می دهد (داده های توسعه یافته شکل 3e,f). این داده ها نشان می دهد که در اکثر سناریوها، اما نه همه، NRF2 برای فعال سازی NLRP3 مورد نیاز است.

فراوانی NRF2 و محلی‌سازی هسته‌ای توسط KEAP1 کنترل می‌شود، یک لیگاز یوبی‌کوئیتین که به طور اساسی یوبی‌کوئیتیناسیون و تخریب NRF2 را هدایت می‌کند. مطابق با این ایده، درمان BMDM های جاودانه (iBMDMs) با مهار کننده پروتئازوم MG132 فراوانی NRF2 را در لیزات ماکروفاژها افزایش داد (داده های توسعه یافته شکل 4a). ما اثر سفتی ECM و پرایمینگ LPS را بر برهمکنش‌های KEAP1 و NRF2، فراوانی و محلی‌سازی هسته‌ای آن‌ها بررسی کردیم. فراوانی KEAP1 در لیزات سلولی تحت تأثیر LPS یا شرایط کشت سفتی ECM بالا یا پایین قرار نگرفت (داده های توسعه یافته شکل 2).

4b). اکثر KEAP1 در سیتوزول یافت شد و نه در هسته (داده های توسعه یافته شکل 4b). در مقابل، فراوانی NRF2 و توزیع درون سلولی به این تغییرات در شرایط کشت حساس بودند. سفتی بالای ECM (یعنی پلاستیک) با کمترین فراوانی NRF2 و کمترین مقدار NRF2 هسته ای همراه بود (داده های توسعه یافته شکل 4b). سفتی کم ECM، و تا حد زیادی تیمارهای LPS در شرایط کشت پلاستیک، منجر به افزایش فراوانی NRF2 شد (داده های توسعه یافته شکل 4b). این افزایش در فراوانی NRF2 با جابجایی هسته ای در ارتباط است.

رسوب همزمان KEAP1 و NRF2 برهمکنش بین این پروتئین ها را در حالت پایدار و پس از تحریک LPS نشان داد. میزان تعاملات با فراوانی NRF2 مرتبط بود و با فعال سازی حفظ شد، یافته ای مطابق با گزارش های قبلی 50 (داده های توسعه یافته شکل 4c). این داده ها نشان می دهد که حتی تحت شرایط فعال سازی NRF2، KEAP1 فعالیت های بازدارنده خود را برای مقدار زیادی از کل NRF2 سلولی حفظ می کند.

اگر این مدل درست باشد، می‌توان انتظار داشت که حذف KEAP1 از سلول‌ها، فعالیت‌های NRF2 را فراتر از آنچه با کشت سلول‌ها در ECM پایین به دست می‌آید افزایش دهد. برای آزمایش این ایده، ما موش‌های LysM-cre را با موش‌های Keap1 f/f تلاقی کردیم تا موش‌های دارای کمبود Keap1 (Keap1 ∆M) ویژه ماکروفاژها را تولید کنیم. BMDM از این موش ها برای پاسخ LPS مورد بررسی قرار گرفت. حذف Keap1 در BMDM ها تقریبا 75٪ بود (داده های توسعه یافته شکل 4d). هنگامی که روی پلاستیک قرار گرفتند، BMDM های Keap1 ∆M افزایش فراوانی پروتئین NRF2 و افزایش بیان ژن هدف NRF2 را در مقایسه با BMDM های WT نشان دادند.

4e,f). NRF2 بالا در Keap1 ∆M BMDM ها همچنین رونویسی Il1b تحریک شده با LPS را افزایش داد (داده های توسعه یافته شکل 4g). LPS برای القای تولید IL-1β p17 از Keap1 ∆M BMDMهای کشت شده روی پلاستیک از طریق فرآیند حساس به MCC950 کافی بود (شکل 2i-k). بنابراین، بیان NRF2 برای فعال کردن BMDM ها برای فعال کردن التهاب NLRP3 در پاسخ به LPS کافی است.

برای تعیین اینکه آیا NRF2 به تنظیم سایر پاسخ‌های ماکروفاژ کمک می‌کند، ما BMDM‌های WT، Nfe2l2-/-، Keap1 f/f و Keap1 ∆M را به سمت فنوتیپ M1 (با استفاده از IFNγ و LPS) و فنوتیپ M2 (با استفاده از IL-4 و IL-13) قطبی کردیم. NRF2 برای پلاریزاسیون M1 و M2 در BMDM ها مورد نیاز بود (داده های توسعه یافته شکل 5a-f). علاوه بر این، NRF2 بالا در Keap1 ∆M BMDMs به طور متوسط ​​قطبش M1 را بدون تأثیر بر قطبش M2 افزایش داد (داده های توسعه یافته شکل 5g-l).