برجستگی های دینامیکی تحرک خزنده را در باستانی آسگارد واسطه می کنند

تحرک خزنده مشخصه سلول های یوکاریوتی است و به اسکلت سلولی اکتینی پویا، چسبندگی تنظیم شده و مسیرهای سیگنال دهی سازمان یافته فضایی نیاز دارد 1، 2. باستان‌های آسگارد، که نزدیک‌ترین خویشاوندان پروکاریوتی شناخته شده یوکاریوت‌ها در نظر گرفته می‌شوند، به طور بالقوه این عملکردها را در مجموعه بزرگ «پروتئین‌های امضای یوکاریوتی» خود رمزگذاری می‌کنند. تعداد کمی از اعضای کشت شده، مورفولوژی سلولی پیچیده ای را نشان می دهند، متشکل از یک بدنه سلولی مرکزی که چندین برآمدگی از آن امتداد می یابد، که با یک اسکلت سلولی مبتنی بر اکتین پر شده است.

در اینجا، میکروسکوپ سلول زنده دو موجود زنده از دودمان Lokiarchaea و Hodarchaea 7، 9 نشان داد که آنها به طور پویا و بسیار شکل سلول خود را در مقیاس زمانی دقیقه تغییر می‌دهند و به ترتیب با سرعت 1.5 تا 4.8 میکرومتر در دقیقه، برآمدگی‌های گسترده خود را رشد داده و جمع می‌کنند. سلول ها پس از چسبیدن به سطح شیشه ای از برجستگی های خود برای انجام حرکت خزنده فعال استفاده می کنند. با این حال، در حضور مهارکننده‌های اکتین انتخاب شده، پویایی مشاهده‌شده متوقف شد، که نقش مرکزی اکتین را در این فرآیندها نشان می‌دهد.

انعطاف‌پذیری و تحرک سلولی مشاهده‌شده ویژگی‌های منحصربه‌فردی در میان پروکاریوت‌ها هستند و ممکن است برای ظهور اولین سلول‌های یوکاریوتی که گمان می‌رود از طریق ارتباط یکی از اعضای کهن‌آسگارد و یک پروتئوباکتری α، جد میتوکندری‌ها شکل گرفته‌اند، حیاتی باشد.

از زمان کشف یک دهه پیش، باستان‌های آسگارد (که اکنون به طور رسمی به عنوان شاخه Promethearchaeota یا Asgardarchaeota 5، 8 طبقه‌بندی می‌شوند) مدل‌های جدیدی برای یوکاریوژنز 10، 11، 12، 13، 14 الهام گرفته‌اند. ژنوم آن‌ها پروتئین‌های به اصطلاح امضای یوکاریوتی (ESPs) متعددی را رمزگذاری می‌کند، از جمله، به عنوان مثال، ESCRT و ماشین‌های ubiquitination، یک اسکلت سلولی مبتنی بر اکتین و پروتئین‌های مرتبط، و همچنین بسیاری از GTPase‌های کوچک که هرگز به این میزان در سایر پروکاریوت‌ها یافت نشدند.

تجزیه و تحلیل مبتنی بر ساختار اخیر، تعداد زیادی از ESPها را در ژنوم‌های مونتاژ شده با متاژنوم نشان داد. اعضای Promethearchaeota اکنون به عنوان نزدیکترین خویشاوند پروکاریوتی یوکاریوت ها و احتمالا به عنوان اجداد مستقیم آنها در حدود 2 میلیارد سال پیش در نظر گرفته می شوند (مراجعه 6، 9، 17). اگرچه مدل‌های کنونی یوکاریوژنز در جزئیات مکانیکی متفاوت است، اکثر آنها موافقند که یوکاریوت‌ها از همزیستی یا ادغام بین یک آرکئون از دودمان Promethearchaeota و حداقل یک α-Proteobacterium (یا مرتبط)، که به میتوکندری تکامل یافته‌اند، پدید آمده‌اند.

تعداد معدودی از سلول‌های باستانی آسگارد ۷، ۹، ۱۰، ۲۰، ۲۱، ۲۲ که تاکنون کشت شده‌اند، مورفولوژی سلولی متمایزی را نشان داده‌اند: یک بدنه سلولی مرکزی که از آن برآمدگی‌هایی با تعداد و طول‌های مختلف گسترش می‌یابد. علاوه بر این، غشای بیرونی توسط دیواره سلولی پوشیده نشده بود، اما مشخص شد که با پروتئین هایی تزئین شده است که به طور بالقوه برای ایجاد تماس های سلول-سلول یا تشکیل چسبندگی سلول- بستر استفاده می شود.

بدنه‌ها و برآمدگی‌های سلولی با یک اسکلت سلولی تشکیل شده توسط همولوگ اکتین حفاظت‌شده باستان‌های آسگارد، به نام لوکیاکتین، پر شده‌اند، که یکی از پروتئین‌های بسیار بیان‌شده در Candidatus Lokiarchaeum ossiferum (L. ossiferum) 7 است و بر اساس equins e23، به‌طور نزدیک به equins e23 کاریوتیک مربوط می‌شود. , 24 . مطالعات بیوشیمیایی نشان داده‌اند که پروفایل و ژل‌سولین‌های باستانی آسگارد می‌توانند اکتین یوکاریوتی را پیوند داده و تعدیل کنند، که بیشتر نشان می‌دهد رابطه عملکردی و تکاملی نزدیک این پروتئین‌ها 25، 26، 27.

با قیاس به شبه‌پودیای یوکاریوتی، تنظیم دینامیکی رشته‌های لوکیاکتین می‌تواند رشد و عقب‌نشینی برآمدگی را امکان‌پذیر کند، در نتیجه به شکل‌پذیری مورفولوژیکی و تحرک کمک می‌کند. برای بررسی مستقیم اینکه آیا این فرآیندها در باستان‌های آسگارد اتفاق می‌افتند، تصویربرداری بی‌هوازی سلول زنده ایجاد کردیم و نشان دادیم که هم L. ossiferum و هم Ca. Margulisarchaeum peptidophilum (M. peptidophilum) در عرض چند دقیقه تحت بازآرایی های مورفولوژیکی قابل توجهی قرار می گیرد.

علاوه بر این، هر دو سویه archaea Asgard دارای تحرک خزنده هستند که شامل پویایی گسترده برآمدگی‌های آنها می‌شود و به مهارکننده‌های اکتین حساس است.

L. ossiferum به عنوان یک کشت غنی‌سازی 7 کشت می‌شود و برای آزمایش‌های تصویربرداری، کشت‌هایی با بیش از 1 × 106 L. سلول‌های ossiferum در هر میلی‌لیتر و فراوانی نسبی L. ossiferum 20-60٪ را انتخاب کردیم. ما سلول‌هایی را یافتیم که در عرض 2 ساعت پس از انکوباسیون به طور فعال به سطوح شیشه‌ای می‌چسبند، که کارآمدتر از شرکای سنتروفی آن‌ها از همان فرهنگ بود (Halodesulfovibriae یا Spirochaetes؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل 1a). در این مطالعه، ما فقط مورفولوژی و رفتار سلول‌های چسبنده را توصیف می‌کنیم، بدون اینکه آن‌هایی که در مایع رویی باقی مانده‌اند را شامل شود.

اکثر سلول های چسبنده مورفولوژی مشخصه یک بدنه سلولی مرکزی را با برآمدگی هایی که در همه جهات گسترش یافته بودند نشان دادند (شکل 1a). تعداد و طول برجستگی ها بسیار متفاوت بود، به طور متوسط ​​پنج برجستگی در هر سلول چسبنده (از 1 تا 10) و طول متوسط ​​3.5 میکرومتر (از 1 میکرومتر تا 15 میکرومتر؛ شکل 1b,c). با فرض برآمدگی ها به عنوان یک لوله معمولی 0.25 میکرومتر (0.2-0.3 میکرومتر) و یک بدنه سلولی کاملا گرد با قطر 1.06 میکرومتر (0.8-1.4 میکرومتر) (شکل 1d)، حجم یک برآمدگی منفرد را یک سوم بدنه سلولی، اما تقریبا مساحت سطح موجود را تقریب زدیم.

بنابراین، پنج برآمدگی با طول متوسط، سطح موجود را 4.1 برابر افزایش می‌دهد. به دلیل ظرافت برجستگی ها، ما به طور بالقوه افزایش واقعی سطح سلول را بیش از حد تخمین می زنیم، اما حتی با محافظه کارانه ترین تخمین ها از cryo-EM (متوسط ​​قطر برآمدگی 83 نانومتر؛ رجوع 7)، وجود پنج برآمدگی سطح موجود را دو برابر می کند. جدای از مورفولوژی توصیف شده در بالا، ما همچنین L. ossiferum را با اشکال انحرافی یافتیم، یعنی سلول‌های دراز و چوب مانند که فاقد بدنه سلولی مرکزی بودند.

آنها اقلیت سلول ها را تشکیل می دادند (13.0 ± 10.4٪؛ شکل 1a و داده های توسعه یافته شکل 1b،c). نمونه‌برداری مکرر در طول عمر یک فرهنگ واحد نشان داد که این ویژگی‌های مورفولوژیکی تا حد زیادی پایدار هستند (داده‌های توسعه یافته شکل 1d). تعداد کل سلول های L. ossiferum متصل شده اندکی در طی 12 روز کاهش یافت (داده های توسعه یافته شکل 1e,f). شکل‌های مختلف سلولی که مشاهده کردیم، وجود زیرگروه‌های مختلف سلولی یا بازآرایی دینامیکی مورفولوژی سلول را پیشنهاد می‌کنند.

برای تمایز بین این احتمالات، ما میکروسکوپ تایم لپس را توسط میکروسکوپ کنتراست فاز عمودی (PC) و کنتراست تداخل دیفرانسیل معکوس (DIC) ایجاد کردیم (شکل 1e و ویدیوی تکمیلی 1). برای هر دو روش، محفظه‌های جریان در شرایط بی‌هوازی در اتمسفر N2:CO2 آماده و سپس مهر و موم شدند. میکروسکوپ کامپیوتر بدون کنترل محیطی جو برای آزمایش‌های کوتاه‌مدت، حداکثر 30 دقیقه استفاده شد.

برای میکروسکوپ DIC، اتمسفر اطراف محفظه جریان در 85:15٪ N2: CO2 توسط جریان گاز ثابت به داخل محفظه نگه داشته شد و آزمایش‌ها تا 6 ساعت ثبت شد. در تماس با سطح شیشه، سلول‌های L. ossiferum به سرعت برآمدگی‌های خود را پخش می‌کنند در حالی که بر روی پوشش لنگر می‌مانند (شکل 1f و ویدیوی تکمیلی 2). علیرغم زمان دو برابر شدن آهسته ارگانیسم (حدود 7 روز)، سلول ها مورفولوژی خود را به سرعت در مقیاس زمانی یک دقیقه تغییر دادند.

در بسیاری از موارد، برآمدگی‌های در حال رشد منشعب می‌شوند و بازوهای جانبی را تشکیل می‌دهند که منجر به دو یا گاهی بیشتر انتهای هر برآمدگی می‌شود. علاوه بر این، برجستگی‌ها به طور مداوم رشد کرده و جمع می‌شوند و احتمالا به محیط خود واکنش نشان می‌دهند (شکل 1g، داده‌های توسعه‌یافته شکل 1g،h و ویدیوی تکمیلی 3). برجستگی های منفرد قبل از اینکه به آرامی یا به روشی سریع جمع شوند تا 15 میکرومتر رسیدند. ما از کیموگرافی برای تعیین کمیت این پویایی ها استفاده کردیم و پیدا کردیم که برآمدگی ها در 0.6 ± 1.5 میکرومتر در دقیقه رشد می کنند و انقباضات در دو دسته مجزا رخ می دهند، یا در 0.7 ± 2.0 میکرومتر در دقیقه -1 یا در 6.1 ± 11.4 میکرومتر در دقیقه -1 (شکل.

1 ساعت). تعداد و طول برآمدگی‌های سلول‌های L. ossiferum دارای همبستگی معکوس بود که نشان‌دهنده کنترل دقیق ناحیه غشایی در دسترس برای تشکیل برآمدگی است (شکل 1i). در طول بازآرایی‌های مشاهده‌شده، طول کل بیرون زدگی سلول‌های منفرد ثابت ماند، که بیشتر نشان‌دهنده توزیع مجدد کنترل‌شده چربی‌های غشایی موجود است. (شکل 1j). در نهایت، ما تغییرات شکل قابل توجهی را در اجسام سلولی L. ossiferum مشاهده کردیم: ادغام دو ساختار بدن سلولی در یک ساختار (داده های توسعه یافته شکل 2).

1i ) یا تغییر از حالت چوب مانند به ظاهر کروی (داده های توسعه یافته شکل 1j و ویدیوی تکمیلی 4). این تغییرات مورفولوژیکی تنها به بدن سلولی محدود نمی‌شود، زیرا موقعیت کروموزوم، که با رنگ‌آمیزی زنده با NucBlue آشکار می‌شود، گاهی به صورت دینامیکی بازآرایی می‌شود (داده‌های توسعه یافته شکل 1k و ویدیوی تکمیلی 5).

a، میکروگراف های نمایندگی از میکروسکوپ PC و DIC از L. ossiferum با مورفولوژی های مختلف. b , c , کمیت تعداد برآمدگی در هر سلول (b) و طول برآمدگی (c) از n = 479 سلول. d، تعیین کمیت برآمدگی و قطر بدنه سلولی از حداقل 10 سلول با استفاده از PC، DIC و میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM). اجزای نمودار جعبه تعریف شده در روش ها ("تحلیل تصویر"). e , شماتیک تنظیمات تصویربرداری بی هوازی با PC (بالا) برای تصویربرداری کوتاه مدت (تا 30 دقیقه) و DIC (پایین) برای آزمایش های تصویربرداری طولانی تر (تا 6 ساعت).

آزمایشات نماینده در ویدیوی تکمیلی 1 نشان داده شده است. f، میکروگراف‌های تایم لپس PC از یک سلول L. ossiferum که به اسلاید شیشه‌ای چسبیده است. آزمایش مربوطه در ویدیوی تکمیلی 2 نشان داده شده است. g، میکروگراف DIC با گذشت زمان از یک سلول L. ossiferum با برآمدگی های در حال رشد و کوچک شدن. فلش ها نشان دهنده برجستگی های در حال رشد (صورتی)، در حال کوچک شدن (فیروزه ای) و سریع کوچک شدن (نارنجی) هستند. خط صورتی چین دار خطی است که برای کیموگرافی استفاده می شود. آزمایش مربوطه در ویدیوی تکمیلی 3 نشان داده شده است.

h، کیموگراف های نماینده برآمدگی های در حال رشد، کوچک شدن و کوچک شدن سریع و کمیت های مربوطه (n = 115 برآمدگی از 28 آزمایش از 13 فرهنگ مختلف). i، میانگین طول برآمدگی و تعداد برآمدگی در هر سلول رابطه معکوس دارند (n = 479 سلول). j، تعیین کمیت تغییر در طول کل بیرون زدگی سلول های تک L. ossiferum در میکروسکوپ PC (بالا) و DIC (پایین) (n = 46 سلول و 220 برآمدگی؛ خط ضخیم نشان دهنده میانگین و ناحیه سایه دار نشان دهنده انحراف استاندارد است). میله های مقیاس، 5 میکرومتر (a، f، g).

جدا از مورفولوژی سلول های پلاستیکی و بازآرایی برآمدگی ها، ما بخش قابل توجهی از L. ossiferum را در حال جابجایی بدنه سلولی مرکزی خود یافتیم (51.4 ± 22.5٪؛ داده های توسعه یافته شکل 2a). ما توانستیم انواع متمایز حرکت را تشخیص دهیم. از یک طرف، جابجایی های ناگهانی بدن سلولی در فواصل بزرگتر به دلیل جدا شدن و کشیدن سریع به جلو توسط برجستگی های متصل در جهت مهاجرت مشاهده شد (فیلم تکمیلی 6).

از سوی دیگر، حرکت نسبتا صاف و مداوم در فواصل کوتاه‌تر ظاهر شد، که یادآور حرکت سر خوردن یا خزیدن مشاهده شده در یوکاریوت‌ها بود (شکل 2a و فیلم‌های تکمیلی 6 و 7). اکثر سلول‌های متحرک به‌طور تصادفی روی سطح شیشه مهاجرت می‌کنند، و به طور مداوم جهت‌ها را تغییر می‌دهند، همانطور که در نسبت محصور شدن پایین منعکس می‌شود (اندازه‌گیری جابجایی خالص جسم سلولی از نقطه شروعش نسبت به طول کل مسیر) (شکل 2b,c). فقط یک زیر مجموعه کوچک از L. ossiferum حرکت مداوم را در یک جهت نشان داد (فیلم تکمیلی 7، 6 از 117 سلول).

ما سرعت متوسط ​​مهاجرت اجسام سلولی L. ossiferum را 0.93 ± 1.57 میکرومتر در دقیقه اندازه‌گیری کردیم (شکل 2d و داده‌های توسعه یافته شکل 2b،c). این بسیار کندتر از حرکات شنا است که توسط آرکیاها با استفاده از آرکائلوم (0.18-22.8 میلی‌متر در دقیقه؛ رفر. 28)، باکتری‌های تاژک‌دار (1.5 میلی‌متر در دقیقه؛ رفر. 29)، پروتست‌هایی که از مژگان یا تاژک‌ها استفاده می‌کنند. تحرک (60 میکرومتر در دقیقه-1؛ رجوع 31). در عوض، تحرک L. ossiferum در محدوده سرعت خزیدن گزارش‌شده سلول‌های یوکاریوتی است (0.1-20 میکرومتر در دقیقه-1؛ رفرنس.

32، 33) و تحرک انقباض مبتنی بر پیلی نوع IV Sulfolobus acidocaldarius (1.1 میکرومتر در دقیقه-1)، که تاکنون تنها تحرک سطحی در Archaea 34 توصیف شده بود. اگرچه حرکت پرش به تشکیل پروتئین‌های پیلی خارج سلولی بستگی دارد، مهاجرت L. ossiferum به شکل‌گیری و پس‌کشیدن یا کشیدن برآمدگی‌های غشایی وابسته به نظر می‌رسید که به بهترین وجه به عنوان شبه‌پایان لوله‌ای شکل نازک شناخته می‌شوند. سرعت متوسط ​​مهاجرت اجسام سلولی به طور قابل توجهی شبیه به نرخ رشد بیرون زدگی بود که نشان دهنده ارتباط بالقوه بین این پارامترهای حرکتی است.

هنگام پوشش دادن شیشه با افزایش تدریجی غلظت پلی لیزین، کاهش همزمان در دینامیک برآمدگی و سرعت مهاجرت مشاهده شد (داده های توسعه یافته شکل 2d-g)، که بیشتر نشان دهنده جفت مکانیکی بالقوه بین کارایی بیرون زدگی شبه پا و جابجایی بدن سلولی است. ما سه حالت مکانیکی قابل تصور انتقال نیرو را بررسی کردیم که می‌توانند حرکت خزنده را تحریک کنند: کشیدن، سر خوردن و هل دادن. مشاهدات میکروسکوپی نشان می دهد که سلول های L. ossiferum می لغزند و می کشند.

کشیدن سلول‌ها با نوک برجستگی‌های پیشرو چسبیده بود، و بدنه سلولی به دنبال آن، گاهی اوقات پس از جدا کردن برآمدگی در پشت بدنه سلولی (فیلم تکمیلی 6). علاوه بر این، کشیدن با کوتاه شدن برآمدگی های پیشرو همراه بود، گویی برآمدگی های غشایی در جلو به عنوان فنرهای چسبنده عمل می کنند (شکل 2e).

حرکت سر خوردن در غیاب این تغییرات شکل ناگهانی رخ داده است، احتمالا به این دلیل که انتقال نیرو در مقیاس مولکولی، یا با تردمیل کردن رشته‌های اکتین 1، 35، 36، 37 یا با پلیمریزاسیون و دپلیمریزاسیون همزمان در جلو و عقب سلول اتفاق افتاده است. حرکت دوم در سلول‌هایی با حرکت مداوم غالب بود، که در آن اجسام سلولی یک برآمدگی را دنبال می‌کردند که به سمت جهت حرکت اشاره داشت (شکل 2f و ویدیوی تکمیلی 7).

برای تأیید این دیدگاه، هم ترازی حرکت بدن سلولی را با جهتی که برآمدگی ها به آن امتداد می یابند (19 سلول) اندازه گیری کردیم. ما متوجه شدیم که جهت حرکت عمدتا توسط برجستگی های جلوی بدن سلولی و شواهد کمی برای هل دادن تعیین می شود. هم ترازی با در نظر گرفتن طول برآمدگی ها بهبود یافت (داده های توسعه یافته شکل 2h و ویدیوی تکمیلی 8).

a، میکروگراف های تایم لپس PC از مهاجرت L. ossiferum و مسیر مربوطه. دایره های چین نشان دهنده موقعیت بدنه سلولی در نقاط زمانی مختلف در مسیر هستند. b، نمونه‌ای از مسیرهای حرکت سلول‌های نماینده L. ossiferum که با میکروسکوپ DIC به‌طور مداوم (چپ)، تحت چندین تغییر جهت (مرکز) و حرکت کاملا تصادفی (راست) حرکت می‌کنند. c، d، کمی TrackMate نسبت محصور شدن (c) و سرعت آنی متوسط ​​(d) L. ossiferum (n = 117 سلول از نه فرهنگ).

e، f، میکروگراف های DIC نماینده L. ossiferum که بدن سلولی خود را از طریق کشیدن (e) و سر خوردن (f) جابجا می کند. بدنه سلولی با رنگ قرمز نشان داده شده است و دایره های خط چین قرمز (نقاط زمانی 6 دقیقه) نقطه شروع مربوط به هر جسم سلولی را نشان می دهد. آزمایشات مربوطه در ویدیوهای تکمیلی 6 و 7 نشان داده شده است. میله های مقیاس، 5 میکرومتر (a، e، f).