تضاد GPCR از طریق سیم کشی مجدد قاچاق گیرنده و تخریب

گیرنده‌های جفت‌شده با پروتئین G (GPCRs) یکی از مهم‌ترین دسته‌های اهداف درمانی را نشان می‌دهند که هنوز به طور کامل به آن پرداخته نشده است. در اینجا ما یک استراتژی برای تضاد عملکردی GPCR از طریق اندوسیتوز با واسطه آنتی‌بادی دوگانه و تخریب لیزوزومی گزارش می‌کنیم. کایمراهای هدف گیری GPCR-TfR1 (GTACs) به کاهش قوی و انتخابی چندین GPCR، از جمله BILF1، RXFP1 و CCR6 دست می‌یابند - اهداف ویروسی، سرطانی و ایمنی که درمان آن‌ها دشوار بوده است 2، 3، 4.

GTACها منجر به مهار کامل سیگنال دهی گیرنده، از جمله سیگنال دهی سازنده، با بیش از یک تا دو مرتبه قدرت بیشتر از آنتاگونیست های آنتی بادی معمولی می شود. با استفاده از مهندسی پروتئین و تصویربرداری چند رنگ سلول زنده، ما یک طراحی تجزیه‌کننده وابسته به زمینه ایجاد می‌کنیم و مکانیسم‌های سلولی را با ارتباط گسترده با فناوری تخریب‌کننده توضیح می‌دهیم. پلت فرم GTAC اندوسیتوز القایی و قاچاق پروتئین را به عنوان مدلی برای مدولاسیون درمانی GPCR ایجاد می کند.

گیرنده های جفت شده با پروتئین G (GPCRs) بزرگترین خانواده گیرنده ها را تشکیل می دهند، با بیش از 800 عضو که نقش اساسی در فیزیولوژی و بیماری دارند. اگرچه حدود یک سوم داروهای تایید شده توسط FDA GPCRs 1 را هدف قرار می دهند، موفقیت درمانی به طور نامتناسبی در یک زیرمجموعه کوچک - به ویژه گیرنده های آمین بیوژنیک - متمرکز می شود، در حالی که بسیاری از گیرنده های متصل به پپتید، گیرنده های چربی، گیرنده های یتیم و گیرنده های حسی ناشناخته باقی می مانند.

مهارکننده‌های فعلی GPCR با رقابت با لیگاندها یا تثبیت ترکیب‌های گیرنده غیرفعال 6 عمل می‌کنند، اما این مکانیسم‌ها را می‌توان با مشکل در ایجاد آنتاگونیست‌های رقابتی با میل ترکیبی بالا به اندازه کافی بالا 7 یا با سیگنال‌دهی سازنده مستقل از لیگاند 3 متوقف کرد. این چالش‌ها اغلب برای GPCR‌های متصل به پپتید و پروتئین، که در آن سیگنال‌دهی اتوکرین یا پاراکرین، همراه با میل ترکیبی بالا و غلظت‌های موضعی لیگاندها، می‌تواند اثربخشی مهار رقابتی را کاهش دهد، بیشتر است.

علاوه بر این، مهندسی آنتاگونیست‌های بیولوژیکی اغلب دشوار است، زیرا پاکت‌های اتصال عملکردی درون گیرنده‌ها دفن شده‌اند. این چالش ها بر نیاز به مکانیسم های جایگزین مدولاسیون GPCR تاکید می کند.

سیگنال دهی درون زا GPCR به صورت پویا توسط قاچاق آندولیزوزوم تنظیم می شود، که در آن درونی سازی، بازیافت و تخریب به شدت با اتصال لیگاند، فسفوریلاسیون داخل سلولی و استخدام β-آرستین همراه است. بر اساس این زیست شناسی، ما پیشنهاد کردیم که نزدیکی القایی به یک گیرنده درونی می تواند به طور مصنوعی باعث اندوسیتوز GPCR و تحویل لیزوزومی به سیگنال دهی گیرنده خاموش شود (شکل 1a).

a , شماتیک قاچاق بومی و مهندسی شده GPCR (سمت چپ). آگونیست‌های بومی معمولا درونی‌سازی GPCR و به دنبال آن بازیافت یا تخریب را القا می‌کنند. GTACها GPCRها را برای تخریب با اعمال نفوذ درونی سازی سریع و سازنده با واسطه TfR1 (وسط) هدایت می کنند. طراحی GTAC (راست): آنتی بادی دو عملکردی با دامنه های اتصال به GPCR و دامنه های اتصال به TfR1 که به یک Fc ذوب شده اند. آنتی بادی کنترل فاقد دامنه های اتصال به TfR1 است. b، سطوح GPCR سطح سلولی (فلوسیتومتری ضد FLAG) پس از درمان با GTACs یا آنتی بادی های کنترل.

سطوح AT1R سطح سلول در سلول های FLAG-AT1R-GFP + TfR1 + Expi293 پس از درمان 6 ساعته. سطوح RXFP1 سطح سلولی در سلول های FLAG-RXFP1 + TfR1 + Expi293 پس از درمان 2 ساعت. سطوح APJ سطح سلولی در سلول های FLAG-APJ + TfR1 + HEK293T پس از درمان 2 ساعته. و سطوح A2AR سطح سلولی در سلول های FLAG-A2AR + TfR1 + Expi293 پس از 6 ساعت درمان. داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار.

ج، فعال‌سازی NFAT-لوسیفراز در سلول‌های FLAG-AT1R + TfR1 + NFAT-Luc + Expi293، پس از 2 ساعت پیش تیمار با 50 نانومولار (سمت چپ) یا غلظت‌های متفاوت (راست) AT1R GTAC یا Nb-Fc، و به دنبال آن تحریک 4 ساعته با غلظت A.9nM یا سمت راست (varfty) داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 4 تکرار بیولوژیکی. d، بکارگیری β-آرستین در سلول‌های FLAG-AT1R-Tango + TfR1 + HTLA (لومینسانس) پس از پیش تیمار به مدت 2 ساعت با 50 نانومولار (سمت چپ) یا غلظت‌های متفاوت (راست) AT1R GTAC یا Nb-Fc، و به دنبال آن 14 ساعت متغیر با غلظت 20 مولار (در سمت راست) ANGII.

داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار بیولوژیکی برای هر دو آزمایش. e، سیگنال‌دهی cAMP ناشی از RLN2 در سلول‌های FLAG-RXFP1 + TfR1 + GloSensor + HEK293T (لومینسانس) پس از 2 ساعت پیش تیمار با 10 نانومولار (سمت چپ) یا غلظت‌های متفاوت (راست) RXFP1 GTAC یا کنترل (به دنبال تحریک با غلظت متغیر 3 دقیقه) 1 نانومتر (راست). داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار بیولوژیکی. نمودارهای a، c و e ایجاد شده در BioRender. ژو، ایکس. https://biorender.com/hymki1y (2026).

PROTACهای مولکولی کوچک و چسب‌های مولکولی، ماشین‌های پروتئازومی داخل سلولی را برای تخریب پروتئین هدف به کار می‌گیرند، در حالی که روش‌های مبتنی بر آنتی‌بادی در حال ظهور مانند LYTAC، AbTAC، PROTAB، KineTAC، EndoTag، LIPTAC و قبلا گزارش‌شده‌ای که قبلا گزارش داده‌ایم برای مهار کردن پروتئین‌های سلول‌زدایی از سلول‌زدایی Transsurfaso. , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . با این حال، به‌کارگیری استراتژی‌های مولکولی کوچک برای GPCR تا کنون کارایی محدودی را نشان داده است و کاوش سیستماتیک رویکردهای نزدیکی القایی برای تنظیم GPCR وجود ندارد.

در اینجا، GTACها را معرفی می‌کنیم: آنتی‌بادی‌های دو عملکردی که از درونی‌سازی سریع و سازنده گیرنده ترانسفرین 1 (TfR1) 10، 20 برای کنترل اندوسیتوز، تخریب و سیگنال‌دهی GPCR استفاده می‌کنند (شکل 1a). GTACها به شدت گیرنده آنژیوتانسین II نوع 1 (AT1R) را که یک تنظیم کننده عملکرد قلبی عروقی است، تخلیه و آنتاگونیست می کنند. گیرنده پپتیدی خانواده ریلاکسین 1 (RXFP1)، یک بازیکن کلیدی در دوران بارداری 22 و سرطان 4 . گیرنده کموکاین C-C نوع 6 (CCR6)، تنظیم کننده قاچاق سلول های ایمنی 23. و BILF1، یک GPCR 3 با کدگذاری ویروسی فعال.

AT1R GTAC ها انقباضات تقویت شده با آنژیوتانسین را در قلب های مشتق شده از سلول های بنیادی پرتوان القایی (iPSC) سرکوب کردند. RXFP1 GTACs برنامه‌های ژن متاستاتیک را در سرطان تخمدان کاهش داد. CCR6 GTACs به محاصره کامل کموتاکسی در سلول های ایمنی اولیه و فعالیت ضد التهابی در داخل بدن دست یافتند. و BILF1 GTAC ها سیگنالینگ سازنده را مهار کردند و بیان MHC-I را نجات دادند.

به طور کلی، GTACها بیش از 10-100 برابر قدرت و کارایی بهتری نسبت به آنتاگونیست‌های معمولی نشان دادند، که نشان می‌دهد تخریب القایی نه تنها مهار GPCR را افزایش می‌دهد، بلکه تعدیل گیرنده‌هایی را که هدف قرار دادن آنها با استفاده از فارماکولوژی سنتی دشوار یا غیرممکن است، ممکن می‌سازد.

ما بیشتر این استراتژی را به گیرنده آپلین (APJ)، یک GPCR قلبی عروقی با ایزوفرم های لیگاند متعدد تعمیم می دهیم. گیرنده آدنوزین A2A (A2AR)، یک گیرنده ایمنی در معرض غلظت بالای لیگاند محلی 25; و گیرنده استیل کولین موسکارینی M3 (M3R) 26، یک GPCR فاقد اتصال دهنده های مناسب. ما یک سیستم جهانی GTAC با هدف FLAG را برای بازجویی مدولار و مقیاس‌پذیر از زیست‌شناسی GPCR معرفی می‌کنیم. با استفاده از روش‌های تصویربرداری و دارویی، ویژگی‌های مکانیکی GTACها را تعریف می‌کنیم و استراتژی‌های مهندسی پروتئین را برای تنظیم GPCR وابسته به زمینه شناسایی می‌کنیم.

در مجموع، این مطالعات اندوسیتوز و تخریب القایی را به عنوان یک مکانیسم مدولار برای تضاد GPCR ایجاد می‌کنند و بسته دارویی را برای گیرنده‌هایی که با مهار مبتنی بر اشغال مرسوم توجه ضعیفی دارند، گسترش می‌دهد.

ما پانلی از GPCR با لیگاندهای متنوع، ویژگی های سیگنال دهی و قاچاق، از جمله AT1R، RXFP1، APJ و A2AR را برای توسعه فناوری GTAC جمع آوری کردیم. همه گیرنده‌ها حاوی یک برچسب FLAG N ترمینال، با یک برچسب HA اضافی N ترمینال یا همجوشی GFP C ترمینال در برخی موارد هستند، و در سلول‌های HEK293T یا Expi293 با TfR1 همراه با یک برچسب اپی توپ V5 (TfR1-v5) بیان می‌شوند. سیستم‌های بیان بیش‌ازحد برچسب‌گذاری شده معمولا در تحقیقات GPCR استفاده می‌شوند، زیرا بیان درون‌زای پایین اغلب آنالیزهای سیگنالینگ را محدود می‌کند.

GTACها به عنوان آنتی‌بادی‌های دوتخصصی شامل پیوند(های) GPCR، بایندر(های) TfR1 و IgG1 Fc انسانی از طریق همجوشی یا دستگیره‌های همودایمر در سوراخ‌های 28 ساخته شدند (شکل 1a و شکل‌های تکمیلی 2-4). بایندرهای مورد استفاده عبارتند از TfR1 scFv H7 (مرجع 29) یا نانو جسم (Nb) VHH-A (مرجع 30)، AT1R Nb AT118-L (مرجع 31)، APJ Nb JN241 (مرجع 32)، A2AR scFv Hu3F6 (ref. 30) Rx002 (مراجعه 34، 35) (داده های توسعه یافته شکل 1a و شکل های تکمیلی 2a،b، 3a و 4a).

کاهش سطح سلولی GPCR با فلوسیتومتری پس از درمان با GTACs یا کنترل‌های بایندر GPCR ارزیابی شد. برخلاف کنترل‌ها، GTACها به طور موثر تا 40 تا 90 درصد از سطح سلولی AT1R، RXFP1، APJ و A2AR را با IC 50s نانومولار پیکومولار تا تک رقمی کاهش دادند (شکل 1b). در سلول های FLAG-AT1R-GFP + TfR1 + Expi293، AT1R GTAC همچنین فلورسانس GFP را کاهش داد، که نشان دهنده تخریب کل پروتئین است (Dmax = 65٪، DC 50 ≈ 1 نانومولار) (داده های توسعه یافته شکل 1b). کاهش AT1R و APJ در عرض 1 ساعت مشهود بود و حداقل برای 24 ساعت ثابت ماند (داده های توسعه یافته شکل 1c,d).

سینتیک درونی سازی سریع با مطالعات قبلی TransTAC مطابقت داشت 10 . GTACهای غیر هدفمند AT1R به طور قابل توجهی AT1R را تخلیه نکردند، که نشان می دهد که تخلیه مختص هدف است (داده های توسعه یافته شکل 1e).

GTACها همچنین به شدت با سیگنال دهی GPCR مخالفت کردند. AT1R GTACها فعال‌سازی گزارشگر NFAT-لوسیفراز ناشی از آنژیوتانسین II (ANGII) را در سلول‌های FLAG-AT1R + TfR1 + NFAT-Luc + Expi293 و بتا آرستین را در سلول‌های FLAG-AT1R-Tango + TfR1 + HT سرکوب کردند. AT1R Nb یک آنتاگونیست رقابتی است. با این حال، در مقایسه با Nb-Fc، GTAC های AT1R بیش از 10 برابر قوی تر بودند و حداکثر مهار بیشتری را به دست آوردند، با فعالیت تعدیل شده توسط هندسه GTAC و میل ترکیبی TfR1.

RXFP1 به عنوان یک هدف درمانی بالقوه در سرطان تخمدان نقش دارد، اما به دلیل سیگنال دهی اتوکرین 4، میل ترکیبی پیکومولار ریلاکسین-2 (RLN2) و یک سیگنالوزوم ساختاری که به لیگاند 36 بسیار حساس است، مهار آن دشوار است. مهارکننده های آنالوگ RLN2 موجود دارای قدرت متوسطی هستند 37 و هیچ آنتاگونیستی به توسعه بالینی نرسیده است. ما GTACها را با یک Nb رقابتی RLN2 ساختیم که قبلا با استفاده از نمایشگر سطح مخمر 34 تولید کرده بودیم (داده های توسعه یافته شکل 2a,b).

Nb به RXFP1 روی سلول ها متصل شد (EC 50 ≈ 50 nM) اما تضاد عملکردی محدودی را نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 2b). بلوغ میل ترکیبی اتصال را بهبود بخشید (EC 50 ≈ 2 نانومولار، Ki = 340 pM)، اما مهار سیگنال‌دهی حتی در غلظت‌های میکرومولار کم بود (داده‌های توسعه یافته شکل 2b-d).

RXFP1 GTACها اتصال نانومولار به زیر نانومولار روی سلول را نشان دادند و به طور موثری هم سطح و هم کل RXFP1 را در سلول‌های FLAG-RXFP1-GFP + TfR1 + Expi293 تخلیه کردند (تکمیل داده‌ها شکل‌های 2f,g و 3a,b). در یک رده سلولی القایی با داکسی سایکلین، سیگنالینگ cAMP با بیان سطحی RXFP1 مقیاس شده است (داده های توسعه یافته شکل 2e). مطابق با این، کاهش RXFP1 با واسطه GTAC منجر به تضاد تقریبا کامل سیگنال‌دهی RLN2 در سنجش cAMP تقسیم لوسیفراز با استفاده از سلول‌های FLAG-RXFP1 + TfR1 + GloSensor + HEK293T شد (شکل 1e و داده‌های Extended).

قوی ترین سازه (IC 50 ≈ 30 pM) بیش از 200 برابر قوی تر از Nb-Fc بود و باعث کاهش مداوم گیرنده و مهار سیگنالینگ شد (شکل 1e و داده های توسعه یافته شکل 2i). GTACها بر سیگنال‌دهی cAMP ناشی از فورسکولین تأثیر نمی‌گذارند، مطابق با مکانیسم عمل خاص هدف.

سپس فعالیت GTAC را در کارسینوم تخمدان سروزی با درجه بالا، که در آن TfR1 به صورت درون زا بیش از حد بیان می‌شود، ارزیابی کردیم. به دنبال پیش تیمار GTAC و تحریک RLN2، تجزیه و تحلیل qPCR کاهش قابل توجهی را در ژن‌های هدف RXFP1، از جمله MMP9 و MMP23B (بازسازی ECM)، NOTCH1 و NOTCH3 (سیگنال‌گذاری شکاف) و DVL1 (سیگنال‌دهی Wnt) نشان داد (داده‌های توسعه‌یافته-شکل 2j). این نتایج نشان می دهد که کاهش RXFP1 با واسطه GTAC به طور موثر برنامه های رونویسی انکوژنیک پایین دست را سرکوب می کند.

آزمایش‌ها با AT1R، RXFP1، APJ و A2AR نشان می‌دهند که GTACها یک رویکرد مدولار و به طور گسترده برای القای تخلیه و تخریب سریع و پایدار GPCR هستند. GTACها قدرت و اثربخشی قابل توجهی در مهار سیگنالینگ بیشتری نسبت به Nbs آنتاگونیست به دست آوردند، که نشان می دهد تخریب ناشی از آن می تواند تضاد GPCR را افزایش دهد.

گیرنده های خارج سلولی با برچسب FLAG به طور گسترده در تحقیقات GPCR استفاده می شود. ما از آنتی بادی 39 قطعه ضد FLAG M2 استفاده کردیم تا یک GTAC هدف‌گیری FLAG ایجاد کنیم، که یک استراتژی هدف‌گیری ارائه می‌کند که با اتصال لیگاند درون‌زا تداخلی ایجاد نمی‌کند (شکل 2a و داده‌های توسعه‌یافته شکل 4a). FLAG GTAC در مقایسه با AT1R GTAC در سلول های FLAG-HA-AT1R-GFP + TfR1 + Expi293، اتصال نانومولاری و فعالیت درونی سازی و تخریب مشابهی را نشان داد (شکل 2b و داده های توسعه یافته شکل 4b،c). علاوه بر این، FLAG GTAC از جذب β-آرستین ناشی از ANGII جلوگیری کرد، در حالی که FLAG-Fab سیگنال‌دهی را مختل نکرد (شکل 2).

2c,d). میکروسکوپ کانفوکال نشان داد که AT1R در سطح سلول در سلول‌های تیمار نشده و تیمار شده با FLAG-Fab-Fc توزیع شده است، در حالی که تیمار FLAG GTAC باعث تشکیل نقطه‌های درون سلولی و حدود 60 درصد از دست دادن سیگنال GFP پس از 6 ساعت می‌شود (شکل 2e).

الف، شماتیکی از GTAC های FLAG که FLAG-GPCR ها را تخلیه می کنند. b، AT1R سطح سلولی (چپ، فلوسیتومتری ضد HA) و AT1R کل (راست، فلورسانس GFP) در سلول های FLAG-HA-AT1R-GFP + TfR1 + Expi293 پس از 6 ساعت درمان FLAG GTAC یا Fab-Fc. داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار. ج، بکارگیری β-آرستین در سلول های FLAG-AT1R-Tango + TfR1 + HTLA (لومینسانس) پس از 2 ساعت پیش درمانی با FLAG GTAC یا Fab-Fc، سپس تحریک ANGII (14 ساعت، 200 نانومولار). d، پیش تیمار به مدت 2 ساعت با 50 نانومولار FLAG GTAC یا Fab-Fc، سپس ANGII (14 ساعت). داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار بیولوژیکی.

e، مقدار کل AT1R (سمت چپ، GFP در هر سلول) و میکروسکوپ کانفوکال سلول زنده سلول های FLAG-AT1R-GFP + TfR1 + Expi293 (راست) پس از درمان FLAG GTAC یا Fab-Fc. نوار مقیاس، 20 میکرومتر. مراکز نشان دهنده میانه ها هستند. کران جعبه نشان دهنده صدک های 25 تا 75 است. و سبیل ها حداقل و حداکثر را نشان می دهند. داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 4 سلول. f، شماتیک BILF1 را نشان می دهد که NF-kB را فعال می کند و MHC-I را کاهش می دهد.

g، BILF1 سطح سلولی (چپ، ضد HA) و فعالیت گزارشگر NF-κB (راست، GFP) در سلول های FLAG-HA-BILF1 + TfR1 + NF-κB-GFP + HEK293T پس از درمان FLAG GTAC یا Fab-Fc. داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار بیولوژیکی. h، آنتی بادی FLAG متصل به سطح (ضد FLAG) روی سلول های القایی FLAG-BILF1 + Raji پس از FLAG GTAC یا تیمار کنترل (2 ساعت، 25 نانومولار، 0 درجه سانتی گراد یا 37 درجه سانتی گراد). مقایسه‌های آماری با استفاده از آزمون‌های t دو دنباله جفت نشده. داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 3 تکرار بیولوژیکی.

i، MHC-I سطح سلولی در FLAG–BILF1 + Raji پس از FLAG GTAC یا تیمار کنترل (سمت چپ، ضد HLA-ABC، % القا نشده؛ راست، % تغییر از القایی به غیرالقائی). مقایسه‌های آماری با استفاده از آزمون‌های t دو دنباله جفت نشده. داده ها نشان دهنده میانگین ± s.d. از n = 4 تکرار بیولوژیکی. * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001، **** P <0.0001. مقادیر دقیق P در جدول تکمیلی 7 ارائه شده است. نمودارهای a و f ایجاد شده در BioRender. ژو، ایکس. https://biorender.com/hymki1y (2026).

فعالیت گیرنده مستقل از لیگاند را نمی توان با آنتی بادی های خنثی کننده مهار کرد. یک مثال BILF1 است. بیان شده در طول چرخه لیتیک ویروس اپشتین بار (EBV)، BILF1 سیگنال‌های مستقل از لیگاند را نشان می‌دهد، ICAM1 را از طریق فعال‌سازی مسیر NF-kB تنظیم می‌کند و MHC-I را کاهش می‌دهد، و در نتیجه به تداوم ویروسی و فرار ایمنی کمک می‌کند (شکل 2f). در سلول های FLAG-HA-BILF1 + TfR1 + NF-κB-GFP + HEK293T، GTAC های FLAG به شدت BILF1 سطح سلولی را تا 70 تا 80 درصد کاهش دادند و بیان GFP مبتنی بر NF-κB را سرکوب کردند (IC 50 ≈ 1t0) شکل 4d).

میکروسکوپ کانفوکال درونی سازی BILF1 با واسطه GTAC قابل توجهی را در سلول های FLAG-HA-BILF1 + TfR1-v5 + HEK293T نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 5a,b). در سلول‌های FLAG–BILF1 + Raji، تیمار FLAG GTAC باعث درونی‌سازی BILF1 در دمای 37 درجه سانتی‌گراد شد (مرجع 20) (شکل 2h و داده‌های توسعه‌یافته شکل 4e). القای بیان بیش از حد BILF1 در سلول های راجی بیان MHC-I سطح سلول را کاهش داد که با درمان FLAG GTAC بازسازی شد (شکل 2i). این نتایج توانایی GTACها را برای مهار عملکردی فعالیت سازنده GPCR نشان می‌دهد.

M3R، هدفی برای اتساع برونش در درمان آسم و بیماری انسدادی مزمن ریه (COPD) 26، در حال حاضر فاقد آنتی‌بادی‌های با میل ترکیبی و انتخابی بالا گزارش‌شده است. فلوسایتومتری و وسترن بلات نشان داد که FLAG GTAC ها میل ترکیبی نانومولاری را نشان می دهند و تا حدود 70 درصد تخریب M3R را در سلول های FLAG-M3R + TfR1 + Expi293 القا می کنند (داده های توسعه یافته شکل 4f,g). علاوه بر این، FLAG GTAC با جذب β-آرستین ناشی از ایپروکسو در سلول های FLAG-M3R-Tango + TfR1 + HTLA مخالفت کرد (I max = 58٪، IC 50 ≈ 2 nM) (داده های توسعه یافته شکل.

4h)، کاربرد آن را برای تعدیل GPCRهایی که فاقد بایندرهای خاص هستند، برجسته می کند.

این مطالعات با هم نشان می‌دهند که FLAG GTACها ابزاری جهانی برای بررسی بیولوژی GPCR ارائه می‌کنند. با استفاده از چسبی که علیه یک اپی توپ بی اثر عمل می کند، FLAG GTAC ها کاهش GPCR، تضاد و محاصره فعالیت سازنده را بدون تکیه بر یک بایندر GPCR خاص امکان پذیر می کنند.

CCR6 واسطه جذب سلول های ایمنی به بافت های ملتهب 2 است و در زیر مجموعه های سلول های T، سلول های B، نوتروفیل ها و سلول های دندریتیک بیان می شود. این یک هدف دارویی در بیماری های خودایمنی و التهابی، از جمله پسوریازیس، آرتریت روماتوئید و کولیت اولسراتیو است 2، 41. با این حال، هیچ درمان تایید شده برای هدف قرار دادن CCR6 وجود ندارد، و آنتاگونیست‌های کنونی محاصره ناقص یا گزینش‌پذیری محدود را نشان می‌دهند 41، 42 به دلیل غلظت‌های موضعی کموکاین، همسانی توالی، یک پاکت اتصال لیگاند دو اپی توپی و میل اتصال نانومولاری کم برای C-C ligand20e (3L CC20).

RXFP1 GTAC و نسل گذشته TransTACها از یک بایندر TfR1 رقابتی با میل ترکیبی بالا (H7) برای افزایش بیان TfR1 در تومورها استفاده کردند. با این حال، هدف قرار دادن GPCR ها در سلول های غیر سرطانی ممکن است به کاهش تعامل TfR1 و اتصال غیر رقابتی برای حفظ هموستاز آهن نیاز داشته باشد. بنابراین، ما یک طراحی نسل دوم GTAC را توسعه دادیم که از چسب های TfR1 غیررقابتی و کم میل ترکیبی استفاده می کرد (شکل 3a).

با شروع از یک Nb VHH-A غیررقابتی، ما انواع Nb TfR1 HIGH، TfR1 INT1، TfR1 INT2 و TfR1 LOW را بیان کردیم که طیفی از قرابت ها را در بر می گیرد (Kd ≈ 0.1-120 nM) 30 (شکل 7a و داده های Exted. 3b). GTAC های هدف گیری CCR6 با جفت کردن این گونه ها با یک فاب ضد CCR6 متصل شونده N (4H11، Kd ≈ 500 pM) 44 ساخته شدند (شکل 3d و شکل تکمیلی 5). FLAG-CCR6 در سلول های Jurkat، که به طور درون زا سطوح بالایی از TfR1 را بیان می کنند، بیش از حد بیان شد.