ژنتیک انسانی یک محور BACH2-NRF2 را در فعال سازی هموگلوبین جنین دخیل می کند.

مطالعات ژنتیکی انسانی تنظیم کننده های کلیدی بیان هموگلوبین جنینی (HbF) از جمله BCL11A را شناسایی کرده اند که منجر به پیشرفت های درمانی 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8 شده است. با این حال مکانیسم هایی که توسط آن بیان HbF فعال می شود به طور ناقص شناخته شده است 9 . در اینجا ما یک مطالعه ارتباط گسترده ژنومی چند اجدادی را در مورد سطوح HbF در 28279 فرد انجام می دهیم که 91 انجمن مستقل مشروط را در 12 منطقه ژنومی شناسایی می کند.

در یک منطقه مرتبط که قبلا مشخص نشده بود، نوع علت و معلولی مرتبط با HbF بالا rs1010474-C بیان BACH2 را کاهش می دهد و سطح HbF را افزایش می دهد. اختلال مستقیم یا مهار BACH2 نیز بیان HbF را افزایش می دهد. از نظر مکانیکی، BACH2 فعال سازی ژن های γ-گلوبین کدکننده HbF را مهار می کند، در حالی که از دست دادن BACH2 اشغال کروماتین NRF2 را افزایش می دهد و تشکیل کانون های فعال سازی در ژن های γ-گلوبین را تقویت می کند.

اگرچه نقوش اتصال BACH2 و NRF2 در پروموترهای γ-گلوبین با هم همپوشانی دارند، می توان آنها را به صورت انتخابی ویرایش کرد تا به ترتیب γ-گلوبین را فعال یا سرکوب کرد و این کار را مستقل از BCL11A انجام داد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که چگونه تنوع ژنتیکی انسان به پیشرفت درک ما از مکانیسم‌های تنظیمی مرتبط با بیان HbF ادامه می‌دهد.

در طول رشد انسان، هموگلوبین اندکی پس از تولد از فرم جنینی (HbF؛ حاوی γ-گلوبین، یک گلوبین β-مانند کدگذاری شده توسط HBG1 و HBG2) به شکل بالغ (HbA؛ حاوی β-گلوبین کدگذاری شده توسط ژن HBB) تغییر می کند. این فرآیند به عنوان سوئیچ هموگلوبین جنین به بزرگسال 1 نامیده می شود. افزایش مداوم تولید HbF پس از نوزادی می تواند علائم بالینی در اختلالات شایع و تهدید کننده زندگی ناشی از جهش HBB، از جمله بیماری سلول داسی شکل و بتا تالاسمی را بهبود بخشد.

در حالی که اثرات بهبود دهنده HbF در این اختلالات هموگلوبین برای دهه ها شناخته شده است، مکانیسم های تنظیم کننده HbF و استراتژی های هدف قرار دادن آنها به تازگی مشخص شده است. مطالعات اولیه ارتباط گسترده ژنومی (GWASs) سه ناحیه مرتبط با سطح HbF را نشان داد - مکان HBB در کروموزوم 11، مکان HBS1L - MYB در کروموزوم 6 و مکان BCL11A در کروموزوم 2 (مراجعه 10، 11، 12). این مطالعات باعث پیگیری عملکردی شد که BCL11A را به عنوان یک مهارکننده کلیدی و مستقیم رونویسی HBG1/2 نشان داد.

متعاقبا، بینش‌های بیشتری از مطالعه جهش‌های نادر از دست دادن عملکرد که بر BCL11A 13، 14 تأثیر می‌گذارند، پدیدار شد. عناصر تنظیمی رونویسی لازم برای بیان اریتروئیدی BCL11A 15, 16; تنظیم کننده های بالادست بیان BCL11A 17، 18، 19; و تجزیه و تحلیل مکانیسم هایی که توسط آن BCL11A رونویسی را تغییر می دهد 20، 21، 22.

هدف قرار دادن BCL11A، تقویت‌کننده اختصاصی اریتروئید آن یا مکان‌های اتصال آن در پروموترهای HBG1/2 با استفاده از روش‌های ویرایش ژنوم یا ژن‌درمانی، به‌عنوان استراتژی‌های درمانی مؤثر برای بیماری سلول داسی شکل و بتا تالاسمی ظاهر شده‌اند. علاوه بر این، مطالعات عملکردی در مدل‌های سلولی سایر تنظیم‌کننده‌های HbF، بینش‌هایی را ارائه کرده‌اند.

علیرغم پیشرفت قابل توجهی در درک تنظیم HbF، که عمدتا از مطالعات در رده‌های سلولی و مدل‌های موش حاصل شده است، بسیاری از سؤالات اساسی در مورد چگونگی تنظیم HbF در انسان در داخل بدن بی‌پاسخ باقی مانده‌اند. اکثریت تنظیم کننده های تایید شده ژنتیکی بیان HbF که تا به امروز شناسایی شده اند، سرکوبگر هستند. با این حال، مکانیسم‌های دقیقی که توسط آن‌ها ژن‌های γ-گلوبین فعال می‌شوند به طور کامل شناخته نشده‌اند. علی‌رغم پیشرفت در درک مکانیسم‌های زیربنایی بیان HbF، بسیاری از تنظیم‌کننده‌های واقعی این فرآیند احتمالا تعریف‌نشده باقی می‌مانند.

برای رسیدگی به این محدودیت‌ها، ما یک GWAS چند اجدادی سطوح HbF را در ۲۸۲۷۹ فرد از جمعیت‌های مختلف انجام دادیم. ما BACH2 را به‌عنوان یک تنظیم‌کننده ژنتیکی بیان HbF شناسایی کردیم که با مهار فعال‌سازی رونویسی با واسطه NRF2 ژن‌های γ-گلوبین عمل می‌کند. در مجموع، این یافته‌ها نقشی را برای محور BACH2-NRF2 در تنظیم HbF تعریف می‌کنند و راه‌های درمانی بالقوه را برای اختلالات هموگلوبین پیشنهاد می‌کنند.

برای به دست آوردن بینش در مورد تنظیم بیان HbF، ما یک متاآنالیز GWAS چند اجدادی در مقیاس بزرگ انجام دادیم که شامل 28279 فرد از 11 گروه مجزای اروپایی (EUR, n = 22,882, 7 کوهورت)، آفریقایی (AFR, n = 5 ha, 3,00) بود. 1392، 1 همگروهی اجداد (شکل 1a و جدول تکمیلی 1). در متاآنالیز GWAS، ما هیچ تورمی را در آمارهای آزمایش مشاهده نکردیم (ضریب تورم ژنومی (λgc) = 0.99، رگرسیون نمره عدم تعادل پیوندی (LD) = 0.98؛ داده های توسعه یافته شکل 1a-g).

ما 91 سیگنال مستقل مشروط مرتبط با سطوح HbF را در 12 پنجره شناسایی کردیم که هر کدام به‌عنوان فواصل ژنومی 1 مگابایتی با محوریت واریانت‌های سرب مربوطه تعریف شده‌اند (هشت پنجره در آستانه معنی‌داری در سطح ژنوم، P <5 × 10-8، و چهار پنجره در آستانه پیشنهادی × 1، P <0). جداول تکمیلی 2-4).

ما این پنجره‌ها را با ژن‌هایی حاشیه‌نویسی کردیم که ترکیبی از معیارها را برآورده می‌کردند: (1) فاصله از یک نوع مرتبط با معنی‌دار. (2) داده‌های تعامل دوربرد که عناصر تنظیم‌کننده را به ژن‌های سلول‌های اریتروئیدی توسط پروموتر ضبط Hi-C (PCHi-C) مرتبط می‌کند. (3) همبستگی بین بیان ژن و دسترسی کروماتین (توالی RNA (RNA-seq) و سنجش کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز با همبستگی توالی یابی بالا (ATAC-seq)) در سلول های خونساز. و (4) بیان جایگاه صفات کمی (eQTLs) از خون کامل (جدول تکمیلی 5).

فراتر از جایگاه‌های HbF (HBB، HBS1L-MYB و BCL11A)، ما جایگاه‌هایی را در نزدیکی تنظیم‌کننده‌های شناخته‌شده HbF شناسایی کردیم که قبلا در GWAS گزارش نشده بودند، از جمله ZBTB7A و KLF1، و جایگاه‌های حامل ژن‌هایی که قبلا در تنظیم HbF دخیل نبوده‌اند، از جمله USBACHPTC34.

الف، جغرافیای جمعیتی مطالعات شامل و تعداد نمونه مرتبط. توجه داشته باشید که جمعیت تایلندی شامل نسبتی از افراد انتخاب شده برای HbF بالا بود. در جایی که با یک ستاره نشان داده شده است، گروه‌های انتخابی از کنسرسیوم eQTLGen (روش‌ها) گنجانده شده‌اند. جعبه BIOS نشان دهنده سه گروه EUR است که به طور جداگانه تجزیه و تحلیل شده اند، در حالی که سه گروه AFR TOPMed نشان داده شده با هم متاآنالیز شدند تا مجموعه ای از آمار خلاصه را ایجاد کنند (جدول تکمیلی 1). n = 28279 نفر. b، یک متاآنالیز با اثر ثابت HbF چندین مکان ناشناخته را شناسایی کرد.

نمادهای ژنی نشان داده شده، محتمل ترین ژن تاثیرگذار هستند که با استفاده از چندین رویکرد نامزد شده اند. مقادیر P از آزمون‌های z با وزن نمونه دو طرفه که در METAL اجرا شده‌اند به دست آمد. جایگاه‌های مهم ژنومی (P <5 × 10-8) به رنگ سیاه با فلش‌های توپر، و مکان‌های پیشنهادی (P <1 × 10-6) به رنگ خاکستری با فلش‌های چین‌دار برچسب‌گذاری شده‌اند. خطوط چین در 5 × 10 8 × P = و 6 × 1 × 10 P = 6 ترسیم می شوند تا برش های قابل توجه و پیشنهادی در سطح ژنوم را نشان دهند که بونفرونی با ضریب 106 تصحیح شده است.

ج - e، تجزیه و تحلیل‌های خاص اجداد با استفاده از MAMA (روش‌ها) به ترتیب برای پیشینه‌های اجداد اروپایی (c؛ EUR)، آفریقایی (d؛ AFR) و تایلندی (e). مقادیر P با استفاده از آزمون‌های استاندارد والد دو طرفه برای برآورد اثر از تخمین‌گر انقباض چند اجدادی MAMA محاسبه شد. f، تجزیه و تحلیل SCAVENGE با استفاده از داده های تک سلولی ATAC-seq (scATAC-seq) 54 تمایز خون ساز، نشان دهنده غنی سازی قوی TRS در جمعیت اریتروئید اواخر اواخر است.

baso., basophils; CMP، پیش ساز میلوئید مشترک. ery.، سلول های اریتروئید؛ HSC، سلول های بنیادی خونساز؛ LMPP، پیش ساز چند توانی با لنفوئید. g، همبستگی اسپیرمن بین SCAVENGE TRS و نمرات غنی‌سازی موتیف TF chromVAR در سراسر سلول‌های مسیر اریتروئید (محور y) به ترتیب از بالاترین تا پایین‌ترین رتبه‌بندی شد تا نقوش TF را شناسایی کند.

بعدا تجزیه و تحلیل‌های خاص اجداد (جدول تکمیلی 6) را با استفاده از روش متاآنالیز چند اجدادی (MAMA) 24 برای تبار EUR (شکل 1c) یا AFR (شکل 1d) و همچنین برای گروه تایلندی (شکل 1e) انجام دادیم. ما سیگنال‌های ارتباطی تا حد زیادی را در جایگاه‌های اصلی مشاهده کردیم، از جمله در جایگاه‌های BCL11A، HBS1L - MYB، HBB، BACH2 و KLF1 (جدول تکمیلی 6). در میان این جایگاه‌ها با مقادیر قابل توجه MAMA P در تمام اجداد، BACH2 تنها جایگاهی است که قبلا در تنظیم HbF دخیل نبوده است.

ما وراثت‌پذیری سطوح HbF را با استفاده از خویشاوندی تعدیل‌شده با LD (LDAK) تخمین زدیم، چارچوبی که مشارکت‌های هر متغیر را با حسابداری برای فرکانس آلل و ساختار LD محلی مدل‌سازی می‌کند. وراثت پذیری را 0.19 (s.e. = 0.058) در همه گروه ها تخمین زد. برای گروه‌های اجدادی خاص، گروه‌های EUR وراثت‌پذیری 0.25 (s.e. = 0.047)، 0.23 برای AFR (s.e. = 0.26) و 0.40 برای جمعیت تایلندی (s.e. = 0.32) را نشان می‌دهند.

وراثت پذیری صفت بالاتر در جمعیت تایلندی ممکن است به غنی سازی افراد با سطوح HbF بالا نسبت داده شود، که ممکن است تخمین وراثت پذیری را تحت تأثیر قرار دهد. پس از تجزیه و تحلیل غنی‌سازی‌های وراثت‌پذیری برای تغییرات مختلف هیستون یا مناطق ژنومی، غنی‌سازی‌های عمده در عناصر تقویت‌کننده احتمالی دیده شد، که نشان می‌دهد پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNP) که در عناصر تنظیمی ساکن هستند و بالقوه آن‌ها را تغییر می‌دهند، بیشترین سهم را در وراثت‌پذیری مشاهده‌شده در حال حاضر در سطوح HbF دارند.

با توجه به بینش‌های قوی حاصل از تجزیه و تحلیل ژنتیکی فنوتیپ‌های سلول‌های خونی در جمعیت‌های 25، 26، میزان تغییرات ژنتیکی مرتبط با سطوح HbF را نیز بررسی کردیم که ممکن است با این فنوتیپ‌ها همپوشانی ژنتیکی داشته باشد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2b و جدول تکمیلی 7). ما همبستگی ژنتیکی مثبتی را بین سطوح HbF و فنوتیپ های متعدد گلبول های سفید مشاهده کردیم، از جمله تعداد گلبول های سفید (0.007 = P)، بازوفیل (0.015 = P)، لنفوسیت (0.019 = P)، مونوسیت (0.026 = P) و تعداد نوتروفیل (0.00 = P).

یک روند همبستگی مثبت نیز برای تعداد گلبول های قرمز مشاهده شد، اگرچه این به معنی آماری نبود.

ما در مرحله بعد به دنبال کسب بینشی در مورد زمینه های سلولی زیربنای تنوع مرتبط با HbF بودیم. ما انواع را در هر پنجره 1 مگابایتی بر روی انواع مستقل مشروط متمرکز کردیم تا مجموعه‌های معتبری از انواع بالقوه علی را شناسایی کنیم. نیمی از پنجره‌های مکان دارای 95 درصد مجموعه‌های معتبر بودند که وضوح بالایی با 10 نوع یا کمتر داشتند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2c و جدول تکمیلی 8). این گونه های مجموعه معتبر در درجه اول به اینترون ها و مناطق بین ژنی محلی می شوند (داده های توسعه یافته شکل 2d).

سپس از رویکرد SCAVENGE 27 برای شناسایی حالت‌های سلولی مربوطه استفاده کردیم که در آن واریانت‌های نقشه‌برداری دقیق، هم‌محلی قابل‌توجهی با کروماتین در دسترس در سراسر خون‌سازی انسانی نشان دادند. SCAVENGE نقشه‌برداری دقیق احتمالات دربرگیری خلفی و حالت‌های کروماتین تک سلولی را ادغام می‌کند و امتیاز مربوط به صفت (TRS) را محاسبه می‌کند - یک متریک مقیاس‌شده و نرمال‌شده برای کمی کردن نزدیکی یک سلول، در شبکه‌های شباهت سلولی، به آن‌هایی که بیشترین غنی‌سازی را از انواع ویژگی‌های با اطمینان بالا (thatance is) دارند.

ما غنی‌سازی قوی در سلول‌های اریتروئید در مقایسه با سایر انواع سلول‌های خونساز شناسایی کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 2e,f). در وضوح تک سلولی، با استفاده از یک برجستگی شبه زمانی اریتروپوئیزیس انسانی، غنی‌سازی قوی در مراحل اواسط بلوغ اریتروپویزیس یافتیم (شکل 1f). با توجه به این غنی‌سازی‌ها، ما به دنبال تعریف نقوش فاکتور رونویسی تنظیم‌شده (TF) بودیم. همبستگی اسپیرمن بین امتیازهای غنی‌سازی موتیف SCAVENGE TRS و chromVAR 28 TF در سراسر سلول‌های اریتروئید محاسبه شد (شکل 1g و جدول تکمیلی 9).

قابل ذکر است که موتیف های KLF1 و GATA1 برجسته شدند و هر دو TF در تنظیم HbF حیاتی هستند 29. در مجموع، این نتایج مراحل تمایز کلیدی و شبکه‌های نظارتی رونویسی درگیر در تنوع ژنتیکی مرتبط با HbF را برجسته می‌کنند.

برای اولویت‌بندی جایگاه‌ها برای تجزیه و تحلیل بیشتر، ما شواهدی را از متاآنالیز GWAS و تجزیه و تحلیل‌های انجمن خاص اجداد یکپارچه کردیم. هشت جایگاه مهم در سراسر ژنوم در سراسر متا-GWAS شناسایی شد، که پنج مورد از آنها در تجزیه و تحلیل‌های خاص اجداد با استفاده از MAMA نیز مهم بودند و از استحکام آنها در بین جمعیت‌ها حمایت می‌کردند. چهار مورد از این مکان‌ها (BCL11A، HBS1L-MYB، HBB و KLF1) حاوی تنظیم‌کننده‌های HbF هستند، در حالی که BACH2 تنها منبع گزارش‌نشده قبلی بود که به طور مداوم با سطوح HbF در همه گروه‌های خاص اجداد مرتبط بود (داده‌های توسعه یافته شکل 3a).

بنابراین ما BACH2 را برای بررسی بیشتر در اولویت قرار دادیم. برای پالایش سیگنال ارتباط و شناسایی انواع علی، ما نقشه‌برداری دقیق چند اجدادی را با استفاده از MultiSuSiE 30 انجام دادیم، یک توسعه چند اجدادی از چارچوب نقشه‌برداری دقیق SuSiE 31. تجزیه و تحلیل منطقه ژنومی 1 مگابایتی که بر روی BACH2 متمرکز شده است، مجموعه معتبری را شامل 32 گونه کاملا مرتبط شناسایی کرد (شکل 2a و داده های توسعه یافته شکل 3b).

با توجه به LD گسترده در این منطقه، نقشه برداری دقیق آماری به تنهایی نمی تواند یک نوع علت احتمالی یا مجموعه کوچکی از انواع را تعریف کند، بنابراین ما به دنبال ادغام این نتایج با حاشیه نویسی ژنومی عملکردی برای اولویت بندی بیشتر انواع علی احتمالی در این مکان بودیم. برای این منظور، ما انواع نقشه‌برداری دقیق را در تمام اجداد بر اساس نمایه‌های دسترسی کروماتین (ATAC-seq) از سلول‌های خونساز اولیه انسان قطع کردیم.

در میان 32 نوع مجموعه معتبر، rs1010473 و rs1010474 احتمال ورود خلفی نسبتا بالایی دارند و تنها دو موردی هستند که به طور مداوم با کروماتین در دسترس در انواع سلول های خونساز متعدد هم محلی می شوند (داده های توسعه یافته شکل 3c). برای ارزیابی اثرات نظارتی این گونه‌های طبیعی، ما یک گزارشگر لنتی ویروسی حاوی گونه‌های علت احتمالی در این عنصر نظارتی در بالادست یک پروموتر حداقل تولید کردیم.

ما نشان دادیم که این عنصر تنظیمی به عنوان یک تقویت کننده در طول تمایز اریتروئید انسانی عمل می کند و آلل مرتبط با HbF بالا (C) در rs1010474 فعالیت تقویت کننده را کاهش می دهد (شکل 2b و داده های توسعه یافته شکل 3d).

a، توطئه‌های انجمن منطقه‌ای بزرگ‌شده از نقشه‌برداری دقیق چند اجدادی در جایگاه BACH2. سیگنال های ارتباط MAMA (-log 10 [P]) برای گروه های AFR (n max = 4005)، EUR (n max = 22882) و تایلندی (n = 1392) نشان داده شده است. گونه‌های علی کاندیدای اولویت‌دار چند-SuSiE با دایره‌های حاشیه‌دار سیاه نشان داده می‌شوند و با LD (r2) با rs2325259 رنگ می‌شوند، همانطور که با مقیاس رنگ نشان داده شده است. rs2325259، rs1010473 و rs1010474 بیشتر با خطوط آبی عمودی برجسته می شوند.

b، سنجش گزارشگر لنتی ویروسی که فعالیت تقویت‌کننده کاهش‌یافته گونه‌های علت احتمالی BACH2 را نشان می‌دهد، که به عنوان درصد سلول‌های GFP مثبت در روز 6 تمایز اریتروئید اندازه‌گیری می‌شود. n = 3 آزمایش مستقل. c، d، mRNA نسبی BACH2 (c) و سطح پروتئین BACH2 داخل سلولی (d) در CD34 + HSPCهای اولیه انسانی 3 روز پس از ویرایش پایه آدنین rs1010474-C مرتبط با HbF بالا، در مقایسه با کنترل AAVS1. MFI، میانگین شدت فلورسانس. n = 3 آزمایش مستقل.

نسبت بیانی e، f، HBG1/2 (e) و فرکانس سلولی F (f) در روز 13 تمایز اریتروئید در HSPCهای ویرایش شده با AAVS1- و rs1010474-C. نسبت بیان HBG1/2 نسبت به کل بیان HBG1/2 + HBB در اینجا و در سراسر این مطالعه محاسبه شد. n = 3 آزمایش مستقل. g، h، mRNA نسبی BACH2 (g) و سطح پروتئین BACH2 داخل سلولی (h) در CD34 + HSPCهای اولیه انسان 4 روز پس از انتقال با دو shRNA BACH2 یا shRNA کنترل درهم (Scr). n = 3 آزمایش مستقل.

نسبت بیانی i، j، HBG1/2 (i) و فرکانس سلولی F (j) در روز 13 تمایز اریتروئید در HSPCهای ترانسفوده شده با BACH2 shRNA و shRNA کنترل درهم. n = 3 آزمایش مستقل. k، نسبت بیان HBG1/2 در روز 13 تمایز اریتروئید پس از درمان با ترکیب بازدارنده BACH1/2 8 (Comp8). n = 2 (DMSO) و n = 3 (درمان ترکیب 8) آزمایش مستقل. تمام داده ها میانگین ± s.d هستند. تفاوت بین گروه‌ها با استفاده از آزمون‌های t دو دنباله بدون جفت ارزیابی شد.

برای تعریف نقش این عنصر تنظیمی، حذف با واسطه CRISPR-Cas9 را با استفاده از دو جفت RNA راهنما (ENH del1 و ENH del2؛ داده های توسعه یافته شکل 3e,f) انجام دادیم. در جمعیت سلولی ویرایش شده انبوه، تقریبا 40 درصد از آلل‌های BACH2 حذف مورد نظر را انجام دادند که منجر به کاهش سطح mRNA و پروتئین BACH2 شد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 3g-i)، و همچنین القای HbF، بدون هیچ گونه اختلال در تمایز اریتروئید (شکل 3j-1). قابل ذکر است، هیچ ژن دیگری در حوزه مرتبط توپولوژیکی حاوی این عنصر تنظیمی تحت تأثیر قرار نگرفت (توسعه داده‌ها شکل 2).

3 متر). برای بررسی تأثیر تنوع آللی در این عنصر تنظیمی، از یک ویرایشگر پایه آدنین (ABE8e) برای معرفی یک تبدیل T>C در rs1010474 با حدود 40 درصد راندمان ویرایش انبوه استفاده کردیم (داده های توسعه یافته شکل 3n). ما سطوح کاهش یافته mRNA و پروتئین BACH2 را پس از ویرایش مشاهده کردیم (شکل 2c,d)، همراه با القای HbF (شکل 2e,f)، و بدون هیچ گونه آشفتگی آشکار اریتروپوئزیس (داده های توسعه یافته شکل 3o).

این یافته‌ها نشان می‌دهد که rs1010474-C احتمالا نوع عملکردی علی در این مکان است که با کاهش بیان BACH2 در اجداد اریتروئید عمل می‌کند و در نتیجه HbF را افزایش می‌دهد.

با شناسایی اینکه کاهش بیان BACH2 به نظر می‌رسد هدف عملکردی کلیدی نوع مرتبط با HbF بالا rs1010474-C باشد، به دنبال تعریف مکانیسم‌هایی بودیم که توسط BACH2 ژن‌های گلوبین را تنظیم می‌کند. اگرچه TF BACH1 مرتبط در تنظیم ژن گلوبین 32 نقش دارد، کار قبلی در مورد ارزیابی نقش BACH2 در این فرآیند وجود ندارد. ما در ابتدا از knockdown RNA سنجاق سر کوتاه (shRNA) برای کاهش mRNA BACH2 تا 80٪ و پروتئین تا 50٪ در سلول های بنیادی خونساز اولیه و پیش ساز انسان (HSPCs) و در سراسر تمایز اریتروئید استفاده کردیم.

2g,h و داده های توسعه یافته شکل 4a-c). به طور قابل توجهی، از بین بردن BACH2 منجر به تغییرات جزئی در تمایز اریتروئید شد، اما HbF را در طول تمایز اریتروئید القا کرد، همانطور که توسط mRNA HBG1/2 و سلول‌های اریتروئیدی حاوی HbF ارزیابی شد (سلول‌های F؛ شکل 2i,j و داده‌های توسعه‌یافته شکل 4d-h). برای حمایت بیشتر از این مشاهدات، ما فرهنگ‌های متمایزکننده اریتروئید را با ترکیب 833، یک مهارکننده BACH1/2 که سرکوب رونویسی با واسطه BACH ژن‌های هدف NRF2 را تضاد می‌کند، درمان کردیم.

در حالی که درمان سلول‌های اریتروئید در دوزهای مختلف تأثیر کمی یا بدون تأثیر بر تمایز اریتروئید داشت (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4i,j)، ما یک القای وابسته به دوز HbF را مشاهده کردیم (شکل 2k و داده‌های گسترده شکل 4k)، که نقش BACH2 را در تنظیم HbF بیشتر تقویت می‌کند.

در نهایت، ما به دنبال افزایش متقابل بیان BACH2 و ارزیابی نقش آن در بیان ژن گلوبین بودیم. برای مقایسه سلول‌هایی با سطوح مختلف بیان BACH2، ما 30 درصد سلول‌های انتقال‌یافته + GFP را (BACH2-GFP زیاد) و پایین (BACH2-GFP کم) را مرتب کردیم، جایی که GFP از طریق یک سایت ورودی ریبوزومی به cDNA BACH2 مرتبط می‌شود و به عنوان یک پروکسی برای سطوح BACH2.b. ما یک سرکوب وابسته به دوز سطوح HbF را مشاهده کردیم که با سطوح mRNA و سلول های F اندازه گیری شد (داده های توسعه یافته شکل 5c,d).

برخی اختلالات در تمایز اریتروئید در این تنظیمات وجود داشت که بیشتر از طریق بیان بیش از حد BACH2 (حدود 400 برابر) مشهود است (داده های توسعه یافته شکل 5e). با هم، این اختلالات مکمل، BACH2 را به عنوان یک تنظیم کننده مستقیم و حساس به دوز HbF ایجاد می کند.