یک محور سیگنالینگ TBK1/ULK1 استرس لیزوزومی را با فعال سازی TFEB جفت می کند.

سازگاری لیزوزومی با تغییرات محیطی برای هموستاز سلولی و متابولیک حیاتی است و نیاز به هماهنگی توسط کیناز mTORC1 دارد که سیگنال‌های تغذیه‌ای و استرس را به خروجی‌های متمایز و ویژه سوبسترا منتقل می‌کند. کمپلکس FLCN-FNIP (FLCN:FNIP) با کنترل انتخابی توانایی mTORC1 در مهار فاکتور رونویسی EB (TFEB)، یک تنظیم کننده اصلی برنامه های کاتابولیک و یک انکوژن شناخته شده 3، به عنوان یک تنظیم کننده حیاتی عملکرد لیزوزومی عمل می کند. با این حال، نحوه تنظیم فعالیت FLCN:FNIP نامشخص باقی مانده است.

در اینجا ما یک مسیر سیگنالینگ لیزوزومی مستقل از مواد مغذی را شناسایی می‌کنیم که FLCN را از طریق استخدام مبتنی بر v-ATPase از TBK1 یا ULK1 (TBK1/ULK1) به لیزوزوم‌ها از طریق آداپتور TAX1BP1 تنظیم می‌کند. این فسفوریلاسیون FNIP1 با واسطه TBK1/ULK1 در S296 را قادر می‌سازد که منجر به مهار FLCN و انتقال هسته‌ای TFEB می‌شود. جهش‌های مکرر V-ATPase ATP6V1B2 که در بیماران مبتلا به لنفوم فولیکولی یافت می‌شود، این مسیر را فعال می‌کند و منجر به بیش فعال شدن TFEB و تکثیر لنفوم فولیکولی می‌شود.

کار ما یک مسیر سیگنالینگ لیزوزومی را نشان می دهد که برای سازگاری لیزوزومی و تومورزایی حیاتی است.

این یک پیش نمایش از محتوای اشتراک است که از طریق موسسه شما دسترسی دارد

به Nature و 54 مجله Nature Portfolio دیگر دسترسی داشته باشید

Nature+ را دریافت کنید، بهترین اشتراک دسترسی آنلاین ما

قیمت‌ها ممکن است مشمول مالیات‌های محلی باشد که در هنگام تسویه حساب محاسبه می‌شود

داده های پروتئومی در کنسرسیوم ProteomeXchange از طریق مخزن شریک PRIDE با شناسه های مجموعه داده PXD069600 (شکل 2) و PXD063015 (شکل 4) سپرده شده است. برای اطلاعات منبع ژل، به شکل تکمیلی 3 مراجعه کنید. داده ها از نویسنده مربوطه در صورت درخواست معقول در دسترس است. داده های منبع با این مقاله ارائه شده است.

Napolitano، G.، Di Malta، C. & Ballabio، A. سیگنال دهی غیر متعارف mTORC1 در لیزوزوم. Trends Cell Biol. 32، 920-931 (2022).

Goul, C., Peruzzo, R. & Zoncu, R. اساس مولکولی سنجش و سیگنال دهی مواد مغذی توسط mTORC1 در تنظیم متابولیسم و ​​بیماری. نات کشیش مول. سلول بیول. 24، 857-875 (2023).

Napolitano, G. & Ballabio, A. TFEB در یک نگاه. J. Cell Sci. 129، 2475-2481 (2016).

مقاله CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu، G. Y. و Sabatini، D. M. mTOR در پیوند تغذیه، رشد، پیری و بیماری. نات کشیش مول. سلول بیول. https://doi.org/10.1038/s41580-019-0199-y (2020).

Choo، A. Y.، Yoon، S.-O.، Kim، S. G.، Roux، P. P. & Blenis، J. Rapamycin به طور متفاوتی S6Ks و 4E-BP1 را مهار می کند تا سرکوب خاص نوع سلولی ترجمه mRNA را واسطه کند. Proc. Natl Acad. علمی USA 105, 17414–17419 (2008).

مقاله ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burnett, P. E., Barrow, R. K., Cohen, N. A., Snyder, S. H. & Sabatini, D. M. RAFT1 فسفوریلاسیون تنظیم کننده های ترجمه p70 S6 کیناز و 4E-BP1. Proc. Natl Acad. علمی ایالات متحده آمریکا 95، 1432-1437 (1998).

برون، جی جی و همکاران. فسفوریلاسیون سرکوب کننده ترجمه PHAS-I توسط هدف پستانداران راپامایسین. Science 277، 99-101 (1997).

ساردیلو، ام. و همکاران. یک شبکه ژنی که بیوژنز و عملکرد لیزوزومی را تنظیم می کند. Science 325, 473-477 (2009).

Settembre، C. و همکاران. TFEB اتوفاژی را به بیوژنز لیزوزومی پیوند می دهد. Science 332، 1429-1433 (2011).

Settembre، C. و همکاران. یک مکانیسم سیگنالینگ لیزوزوم به هسته، لیزوزوم را از طریق mTOR و TFEB حس کرده و تنظیم می کند. EMBO J. 31، 1095-108 (2012).

Roczniak-Ferguson، A. et al. فاکتور رونویسی TFEB سیگنال دهی mTORC1 را به کنترل رونویسی هموستاز لیزوزوم پیوند می دهد. علمی سیگنال. 5, ra42 (2012).

Martina, J. A., Chen, Y., Gucek, M. & Puertollano, R. MTORC1 با جلوگیری از انتقال هسته ای TFEB به عنوان یک تنظیم کننده رونویسی اتوفاژی عمل می کند. اتوفاژی 8، 877-876 (2012).

ناپولیتانو، جی و همکاران. فسفوریلاسیون وابسته به mTOR صادرات هسته ای TFEB را کنترل می کند. نات اشتراک. 9, 3312 (2018).

مقاله ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sancak، Y. و همکاران. Rag GTPases رپتور را متصل می کند و پیام رسانی اسید آمینه را به mTORC1 واسطه می کند. Science 320, 1496-1501 (2008).

کیم، ای.، گوراکشا هیکس، پی، لی، ال.، نوفلد، تی پی و گوان، ک.-ال. تنظیم TORC1 توسط Rag GTPases در پاسخ به مواد مغذی. نات سلول بیول. 10، 935-945 (2008).

Sancak، Y. و همکاران. کمپلکس Ragulator-Rag mTORC1 را به سطح لیزوزوم هدف قرار می دهد و برای فعال شدن آن توسط اسیدهای آمینه ضروری است. سلول 141، 290-303 (2010).

بار-پلد، ال. و همکاران. یک کمپلکس سرکوبگر تومور با فعالیت GAP برای Rag GTPases که کافی بودن اسید آمینه را به mTORC1 نشان می دهد. Science 340، 1100-1106 (2013).

Tsun، Z.-Y. و همکاران سرکوب کننده تومور فولیکولین یک GAP برای RagC/D GTPases است که سطح اسید آمینه را به mTORC1 سیگنال می دهد. مول. سلول 52، 495-505 (2013).

لارنس، R. E. و همکاران. مکانیسم ساختاری یک ایست بازرسی فعال سازی Rag GTPase توسط کمپلکس فولیکولین لیزوزومی علوم https://doi.org/10.1126/science.aax0364 (2019).

شن، ک. و همکاران. ساختار Cryo-EM مجموعه انسانی FLCN-FNIP2-Rag-Ragulator. سلول 179، 1319-1329 (2019).

ناپولیتانو، جی و همکاران. یک مسیر mTORC1 مخصوص بستر، زمینه ساز سندرم Birt-Hogg-Dubé است. طبیعت https://doi.org/10.1038/s41586-020-2444-0 (2020).

کوی، زی و همکاران. ساختار مگاکمپلکس لیزوزومی mTORC1-TFEB-Rag-Ragulator. Nature 614، 572-579 (2023).

Alesi، N. و همکاران. TFEB باعث بیش فعال شدن mTORC1 و بیماری کلیوی در مجموعه توبروس اسکلروزیس می شود. نات اشتراک. 15, 406 (2024).

عصرانی، ک و همکاران. یک حلقه بازخورد منفی با واسطه mTORC1، فعال‌سازی FLCN-Rag ناشی از اسید آمینه را در سلول‌های کلیوی با از دست دادن TSC2 محدود می‌کند. نات اشتراک. 13, 6808 (2022).

گودوین، جی ام و همکاران. GABARAP کمپلکس سرکوبگر تومور FLCN-FNIP را جدا می کند تا اتوفاژی را با بیوژنز لیزوزومی جفت کند. علمی Adv. 7, eabj2485 (2021).

ناکامورا، اس و همکاران. لیپیداسیون LC3 برای فعال شدن TFEB در طول پاسخ آسیب لیزوزومی به آسیب کلیه ضروری است. نات سلول بیول. 22، 1252-1263 (2020).

Zoncu، R. و همکاران. mTORC1 اسیدهای آمینه لیزوزومی را از طریق مکانیزم درون به بیرون که به H + -ATPase واکولی نیاز دارد، حس می کند. Science 334, 678-83 (2011).

هوپر، K. M. و همکاران. V-ATPase یک تنظیم کننده جهانی فاگوسیتوز مرتبط با LC3 و اتوفاژی غیر متعارف است. J. Cell Biol. 221, e202105112 (2022).

تیمیمی، ال و همکاران. محور V-ATPase/ATG16L1 توسط زیر واحد V1H کنترل می شود. مول. سلول 84، 2966-2983 (2024).

وانگ، اف و همکاران. جهش های مرتبط با لنفوم فولیکولی در ATPase واکوئولی ATP6V1B2 شار اتوفاژیک و mTOR را فعال می کند. جی. کلین. سرمایه گذاری کنید. 130، 1626–1640 (2019).

Wang, F., Yang, Y., Klionsky, D. J. & Malek, S. N. جهش در V-ATPase در لنفوم فولیکولی شار اتوفاژیک را فعال می کند و وابستگی قابل هدف ایجاد می کند. اتوفاژی 19، 716-719 (2023).

Gollwitzer, P., Grützmacher, N., Wilhelm, S., Kümmel, D. & Demetriades, C. کد دایمر Rag GTPase تنظیم mTORC1 را توسط اسیدهای آمینه تعریف می کند. نات سلول بیول. 24, 1394–1406 (2022).

مارتینا، J. A. و Puertollano، R. Rag GTPases واسطه استخدام وابسته به اسید آمینه TFEB و MITF به لیزوزوم هستند. J. Cell Biol. 200، 475-91 (2013).

ژاکین، ای و همکاران. تعدیل‌کننده‌های دارویی اتوفاژی یک مسیر غیر متعارف موازی را فعال می‌کنند که باعث لیپیداسیون غیر متعارف LC3 می‌شود. اتوفاژی 13، 854-867 (2017).

ابو رمیله، م و همکاران. متابولومیک لیزوزومی نشان می دهد که تنظیم وابسته به V-ATPase و mTOR جریان اسید آمینه از لیزوزوم است. Science 358, 807-813 (2017).

نیومن، A. C. و همکاران. اعتیاد به کیناز TBK1 در سلول های سرطان ریه از طریق اتوفاژی Tax1bp1/Ndp52 و سیگنال دهی غیر متعارف NF-kB واسطه می شود. PLoS ONE 7، e50672 (2012).

White, J., Suklabaidya, S., Vo, M. T., Choi, Y. B. & Harhaj, E. W. نقشهای چندوجهی TAX1BP1 در اتوفاژی. اتوفاژی 19، 44-53 (2023).

Le Guerroué, F. et al. TNIP1 از طریق تعامل دوبخشی با LC3/GABARAP و TAX1BP1 از اتوفاژی انتخابی جلوگیری می کند. مول. سلول 83، 927-941 (2023).

Eapen، V. V.، Swarup، S.، Hoyer، M. J.، Paulo، J. A. & Harper، J. W. پروتئومیکس کمی انتخاب پذیری گیرنده های اتوفاژی متصل شونده به یوبیکوئیتین را در گردش لیزوزوم های آسیب دیده توسط لیزوفاژی نشان می دهد. eLife 10، e72328 (2021).

Thurston, T. L. M., Ryzhakov, G., Bloor, S., von Muhlinen, N. & Randow, F. آداپتور TBK1 و گیرنده اتوفاژی NDP52 تکثیر باکتری های پوشیده شده با یوبیکوئیتین را محدود می کند. نات ایمونول. 10، 1215-1221 (2009).

Bauer, B., Idinger, J., Schuschnig, M., Ferrari, L. & Martens, S. استخدام آغازگر اتوفاژی TAX1BP1 باعث پیشرفت آگرفاژی از جمع آوری محموله تا توقیف می شود. EMBO J. 43، 5910–5940 (2024).

فو، تی و همکاران. بینش مکانیکی در مورد تعاملات NAP1 با حوزه های SKICH NDP52 و TAX1BP1. Proc. Natl Acad. علمی USA 115, E11651–E11660 (2018).

ژو، زی و همکاران استرس پروتئوتوکسیک باعث اتوفاژی با واسطه TFEB و TFE3 و بیوژنز لیزوزومی از طریق غیرفعال سازی غیر متعارف MTORC1 می شود. اتوفاژی 22، 726-743 (2026).

فیتزجرالد، K. A. و همکاران. IKKε و TBK1 اجزای ضروری مسیر سیگنالینگ IRF3 هستند. نات ایمونول. 4، 491-496 (2003).

نگوین، تی ان و همکاران. شروع غیر متعارف میتوفاژی PINK1/Parkin توسط Optineurin. مول. سلول 83، 1693-1709 (2023).

فوجیتا، ک. و همکاران. محور ULK Complex-LRRK1 میتوفاژی با واسطه پارکین را از طریق فسفوریلاسیون Rab7 Ser-72 تنظیم می کند. J. Cell Sci. 135, jcs260395 (2022).

جانسون، J. L. و همکاران. اطلسی از ویژگی های بستر برای کینوم سرین/ترئونین انسانی. Nature 613، 759-766 (2023).

یانسن، R. M. و همکاران. مبنای ساختاری برای فعال‌سازی FLCN RagC GAP در تنظیم mTORC1 انتخابی بستر MiT-TFE. علمی Adv. 8, eadd2926 (2022).

Song، W. & Craft، J. T ناهمگونی سلول های کمکی فولیکولی: زمان، مکان و عملکرد. ایمونول. Rev. 288, 85–96 (2019).

Mlynarczyk، C.، Fontán، L. & Melnick، A. لنفوم های ناشی از مرکز ژرمینال: تاریک ترین سمت ایمنی هومورال. ایمونول. Rev. 288, 214-239 (2019).

Caeser, R. et al. اصلاح ژنتیکی سلول‌های B اولیه انسانی برای مدل‌سازی لنفوم با درجه بالا. نات اشتراک. 10, 4543 (2019).

سانکار، D. S. و همکاران. عامل ULK1 BAG2 با تعدیل محلی سازی AMBRA1 شروع اتوفاژی را تنظیم می کند. Cell Rep. 43, 114689 (2024).

ریشتر، بی و همکاران. فسفوریلاسیون OPTN توسط TBK1 اتصال آن به زنجیره های Ub را افزایش می دهد و اتوفاژی انتخابی میتوکندری آسیب دیده را ترویج می کند. Proc. Natl Acad. علمی USA 113, 4039–4044 (2016).

Moore, A. S. & Holzbaur, E. L. F. استخدام و فعالسازی پویا TBK1 مرتبط با ALS با اپتینورین هدف برای میتوفاژی کارآمد مورد نیاز است. Proc. Natl Acad. علمی USA 113, E3349–E3358 (2016).

Heo, J.-M., Ordureau, A., Paulo, J. A., Rinehart, J. & Harper, J. W. مسیر ubiquitylation میتوکندری PINK1-PARKIN برنامه ای برای استخدام OPTN/NDP52 و فعال سازی TBK1 برای ترویج میتوفاژی را هدایت می کند. مول. سلول 60، 7-20 (2015).

مالک، N. و همکاران. القای بیوژنز لیزوزومی و میتوکندری توسط فسفوریلاسیون AMPK FNIP1. Science 380, eabj5559 (2023).

Zoncu، R. & Perera، R. M. نقش های نوظهور عوامل MiT/TFE در سرطان. روند سرطان 9، 817-827 (2023).

Tudorica، D. A. و همکاران. یک فسفوسوئیچ RAB7A تنظیم پروتئین همولوژیکی روبیکون میتوفاژی وابسته به پارکین را هماهنگ می کند. J. Cell Biol. 223, e202309015 (2024).

ما از C. Settembre، J. Font-Burgada، G. Diez-Reux و A. De Matteis برای خوانش انتقادی این نسخه تشکر می کنیم. S. Malek برای ارائه خطوط سلولی بیان کننده انواع ATP6V1B2. و M. Cillo برای کمک به تولید رده های سلولی پایدار OCI-LY19. ما همچنین از امکانات اصلی TIGEM زیر تشکر می کنیم: غربالگری با محتوای بالا، MS، فلوسیتومتری و میکروسکوپ پیشرفته.

این کار توسط کمک‌های مالی از بنیاد تله‌تون ایتالیا (TGM22CBDM09 به G.N.)، بنیاد AIRC (کمک مالی MFAG-23538 و SIS−31821 به G.N.)، Wereld Kanker Onderzoek Fonds (WKOF) به عنوان بخشی از برنامه کمک مالی بین‌المللی صندوق تحقیقات سرطان جهانی (IIG0902F) پشتیبانی شد. (PRIN 2022CRFNCP و PRIN P2022T4PKT به G.N.)، بورس تحصیلی فوق دکتری Scuola Superiore Meridionale (SSM) (A.E.)، دانشگاه و کانتون فریبورگ به عنوان بخشی از شبکه تحقیقاتی SKINTEGRITY.CH و بنیاد ملی علوم سوئیس (شماره های 8 و 22928 J.8 و 22928).

مطالعه GALLIUM (NCT01332968) و تجزیه و تحلیل مشخصات جهش مرتبط توسط F. Hoffmann-La Roche حمایت شد.

موسسه ژنتیک و پزشکی Telethon (TIGEM)، ناپل، ایتالیا

الساندرا اسپوزیتو، کیارا واریاله، ماریا پیا کاوالیره، ماریا السا برونتی، روسلا آگوستینیس، آلسیا کالکاگنی، فابریزیو آندرئونه، یلنیا مونفرگولا، فرانچسکا ساکو، آندریا بالابیو و جنارو ناپولیتانو

Scuola Superiore Meridionale (SSM)، دانشکده مطالعات پیشرفته، برنامه ژنومیک و پزشکی تجربی، ناپل، ایتالیا

الساندرا اسپوزیتو، ماریا پیا کاوالیره، ماریا السا برونتی، آندره آ بالابیو و جنارو ناپولیتانو

گروه زیست شناسی، دانشگاه فریبورگ، فریبورگ، سوئیس

گروه زیست شناسی مولکولی و سلولی، دانشگاه کالیفرنیا برکلی، برکلی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا

راشل ام. جانسن، دن آ. تودوریکا، یونجیا دوان، مارتینا اسپاچی، روبرتو زونکو و جیمز اچ. هرلی

موسسه کالیفرنیا برای علوم زیستی کمی، دانشگاه کالیفرنیا، برکلی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا

راشل ام. جانسن، دن آ. تودوریکا، یونجیا دوان و جیمز اچ. هرلی

واحد ژنتیک پزشکی، گروه علوم پزشکی و ترجمه، دانشگاه فدریکو دوم، ناپل، ایتالیا

آلسیا کالکاگنی، آندره آ بالابیو و جنارو ناپولیتانو

بخش پزشکی III، بیمارستان دانشگاه لودویگ ماکسیمیلیانس (LMU)، مونیخ، آلمان

کارولین دی استروبل، ورنا پاسرینی و الیور ویگرت

آزمایشگاه آزمایشگاهی تحقیقات لوسمی و لنفوم تجربی (ELLF)، کنسرسیوم سرطان آلمان (DKTK)، سایت شریک مونیخ (مشارکت بین DKFZ و بیمارستان دانشگاه LMU)، مونیخ، آلمان

بخش هماتوپاتولوژی، Dpt. آسیب شناسی، بیمارستان دانشگاه شلسویگ-هولشتاین (UKSH)، کیل، آلمان

گروه زیست شناسی، دانشگاه رم تور ورگاتا، رم، ایتالیا

مرکز جامع سرطان (CCC Munich LMU)، دانشگاه Ludwig-Maximilians-Universität (LMU)، مونیخ، آلمان

مرکز تحقیقات سرطان باواریا (BZKF)، بیمارستان دانشگاهی LMU، مونیخ، آلمان

موسسه تحقیقات عصبی جان و دان دانکن، بیمارستان کودکان تگزاس، و گروه ژنتیک مولکولی و انسانی، کالج پزشکی بیلور، هیوستون، تگزاس، ایالات متحده آمریکا

موسسه علوم اعصاب هلن ویلز، دانشگاه کالیفرنیا، برکلی، برکلی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا

A.E و G.N. مطالعه را تصور کرد. A.E اکثر آزمایش ها را طراحی و انجام داد. I.B. سنجش‌های فسفوپروتئومیک و کیناز آزمایشگاهی تحت نظارت J.D. C.V.، M.P.C.، R.A.، M.E.B انجام و آنالیز شد. و A.C برخی از آزمایشات آزمایشگاهی را انجام دادند. R.M.J.، Y.D.، D.A.T. و م.س. خالص سازی پروتئین FLCN:FNIP، فسفوریلاسیون آزمایشگاهی و سنجش فعالیت GAP را تحت نظارت R.Z انجام داد. و J.H.H. F.A و J.M رده های سلولی ویرایش شده با ژن CRISPR-Cas9 را تولید کردند. F.S. داده های MS را تجزیه و تحلیل کرد. C.D.S. سلول های GC B تولید کرد. J.R.، V.P.، W.K. و O.W. داده های بیمار را ارائه و تجزیه و تحلیل کرد.

A.E و G.N. پیش نویس اصلی نسخه خطی را نوشت و A.E.، A.B.، O.W.، J.H.H.، R.Z.، J.D. و G.N در بررسی و ویرایش مشارکت داشتند. G.N. بر مطالعه نظارت کرد.

J.H.H. یکی از بنیانگذاران و سهامدار Casma Therapeutics است و بودجه تحقیقاتی را از Genentech و Hoffmann-La Roche دریافت کرده است. A.B. یکی از بنیانگذاران و سهامدار Casma Therapeutics و عضو هیئت مشاوران Avilar Therapeutics است. سایر نویسندگان هیچ منافع رقیبی را اعلام نمی کنند.

Nature از داوران ناشناس برای کمک آنها در بررسی همتایان این اثر تشکر می کند. گزارش های بازبین همتا در دسترس است.

یادداشت ناشر Springer Nature با توجه به ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های سازمانی بی طرف باقی می ماند.

سلول های HEK293T که به طور پایدار TFEB-GFP را بیان می کنند و با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2، با داکسی سایکلین به مدت 48 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و سپس (1 ساعت) گرسنه ماندند یا گرسنه ماندند و دوباره با اسیدهای آمینه (30') تحریک شدند. عصاره های سلولی تحت بلات ایمنی قرار گرفتند. (B) سلول های HEK293T با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2 با داکسی سایکلین به مدت 72 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و تحت qRT-PCR قرار گرفتند. سطوح mRNA نسبی ژن‌های نشان‌داده‌شده به سطح ACTB نرمال شد و به صورت تغییر برابر نسبت به سلول‌های بیان‌کننده HA-ATP6V1B2 WT بیان شد.

n = 3 تکرار بیولوژیکی. ATP6V1H: *P = 0.0135 (R400Q)؛ ATP6V1C: *P = 0.0347(R400Q))؛ FLCN: ** P = 0.0048 (R400Q)؛ ATP6V1H: **P = 0.0081 (Y371C)؛ ATP6V1C1: **P = 0.0051 (Y371C)؛ FLCN: ***P = 0.0009 (Y371C)؛ CTSF: ***P = 0.0004 (Y371C)، ***P = 0.0003 (R400Q). (C) تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس محلی سازی لیزوزومی mTOR در سلول های HEK293T با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2، گرسنگی از اسیدهای آمینه (-aa) به مدت 60 دقیقه یا گرسنگی و تحریک مجدد با اسیدهای آمینه (3+0).

(D) سلول‌های موجود در (C) با محاسبه ضریب کولوکالیزاسیون Manders برای کلکولاسیون mTOR-LAMP1 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. n = 5 FOV. (E) لیزات‌های سلول‌های HEK293T با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2 با آنتی‌بادی‌های mTOR و به دنبال آن بلات ایمنی انکوبه شدند. (F) سلول‌های WT و NPRL3-KO HEK293T با بیان القایی WT یا R400Q HA-ATP6V1B2 توسط ایمونوفلورسانس برای ارزیابی محلی‌سازی درون سلولی TFEB مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. (G) کمیت درصد سلولها در (F) نشان دهنده TFEB هسته ای.

n = 4 سلول FOV، V1B2-WT، WT. n = 5، V1B2-R400Q، سلول های WT. n = 5، سلول های V1B2-WT، NPRL3-KO. n = 5، سلول های V1B2-R400Q، NPRL3-KO. از آزمون های آنالیز واریانس دو طرفه، دونت (B) و Sidak (D، G) مقایسه چندگانه استفاده شد. ****P <0.0001; ns، قابل توجه نیست. نتایج میانگین ± SEM هستند. میله های مقیاس، 10 میکرومتر.

(الف) آنالیز ایمونوفلورسانس سلول‌های HEK293T با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2، همراه با نشانگر لیزوزومی LAMP1. (B) سلول‌های موجود در (A) با محاسبه ضریب کولوکالیزاسیون Manders برای کولوکالیزاسیون ATP6V1B2-LAMP1 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. n = 5 FOV; ****P < 0.0001 (مقایسه چندگانه ANOVA یک طرفه Dunnett)؛ (C) لیزات از سلول های HEK293T با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2، با دانه های HA انکوبه شدند و با ایمونوبلات با آنتی بادی های نشان داده شده آنالیز شدند. (D) آنالیز وسترن بلات سیتوزولی و غشایی

کسری از سلول های HEK293T با بیان القایی WT، Y371C، یا R400Q HA-ATP6V1B2. (E) تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس سلول‌های HEK293T با بیان القایی WT HA-ATP6V1B2، یا بدون درمان (-) یا تحت درمان با 10 میکرومولار SaliPhe به مدت 3 ساعت. (F) سلول‌های موجود در (E) با محاسبه ضریب کولوکالیزاسیون Manders برای کولوکالیزاسیون HA-ATP6V1B2-LAMP1 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. n = 5 FOV، ***P = 0.0001 (آزمون t جفت نشده). (G) سلول‌های U2OS با 10 میکرومولار SaliPhe به مدت 8 ساعت تحت درمان قرار گرفتند و تحت qRT-PCR قرار گرفتند.

سطوح mRNA نسبی ژن‌های نشان‌داده‌شده به سطوح HPRT نرمال شد و به صورت تغییر برابر نسبت به نمونه‌های تیمار نشده بیان شد. n = 3 تکرار بیولوژیکی. *P <0.05 (FLCN: P = 0.0112)؛ ** P < 0.01 (CTSD: P = 0.0039؛ ATP6V0C: P = 0.0066)؛ ****P <0.0001; (ANOVA دو طرفه، مقایسه چندگانه Sidak). تمام داده ها میانگین ± SEM هستند. میله های مقیاس، 10 میکرومتر.

(الف) سلول‌های WT و NPRL3 KO HEK293T که به‌طور پایدار TFEB-GFP را بیان می‌کنند، یا بدون درمان رها شدند (-)، در معرض گرسنگی اسید آمینه (-aa) به مدت 1 ساعت، یا تحت درمان با 200 نانومولار موننسین (Mon)، 200 نانومولار نیجریسین (Nig. عصاره سلولی با بلات مورد بررسی قرار گرفت. (B) تجزیه و تحلیل کانفوکال مکان یابی لیزوزومی mTOR در سلول های U2OS تحت درمان با 300 نانومولار موننسین (Mon)، 500 نانومولار نیجریسین (Nig) یا 1 میکرومولار سالینومایسین (Sal) به مدت 3 ساعت. (C) سلول های شرح داده شده در (B) با محاسبه ضریب colocalization Manders برای colocalization mTOR-LAMP1 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. n = 4 FOV.

(D) تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس سلول‌های U2OS که به‌طور پایدار TFEB-GFP را بیان می‌کنند، یا بدون درمان رها شدند یا تحت تیمار 300 نانومولار موننسین (Mon)، 500 نانومولار نیجریسین (Nig) یا 1 میکرومولار سالینومایسین (Sal) به مدت 3 ساعت و به‌دنبال آن تیمار 2150 نانومولار برای 3 ساعت قرار گرفتند. (E) سلول‌های موجود در (D) برای محاسبه کولوکالیزاسیون TFEB-LAMP1 (ضریب کولوکالیزاسیون Manders) اندازه‌گیری شدند. n = 5 FOV. از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه، آزمون مقایسه چندگانه دانت (C، E) استفاده شد. ****P <0.0001; ns، قابل توجه نیست. نتایج میانگین ± SEM هستند. میله های مقیاس، 10 میکرومتر.